植物科学和植物病理学》杂志上

ISSN:2575 - 0135

研究文章

检测Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis锡那罗亚番茄和辣椒种子和农业地区,墨西哥

Ruiz阿尔瓦拉多克里斯蒂娜^{1 *},索托Ortiz罗伯特¹,塞万提斯·迪亚兹卢尔德¹Nunez Ramirez菲德尔¹,Celaya-Michel赫尔南²埃达Puente埃德加O²

¹农业科学研究所的自治,墨西哥下加利福尼亚大学
²索诺拉大学农业部和牲畜,公路Hermosillo-Kino湾,墨西哥

*通信地址:Ruiz阿尔瓦拉多克里斯蒂娜,自治的农业科学研究所,墨西哥下加利福尼亚大学电子邮件:erueda04@santana.uson.mx

日期:提交:2018年5月21日;批准:07年6月2018;发表:2018年6月08

本文引用:克里斯蒂娜RA,罗伯托卢尔德CD,菲德尔NR,赫尔南厘米,et al .检测Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis锡那罗亚番茄和辣椒种子和农业地区,墨西哥。J植物Sci Phytopathol。2018;2:044 - 054。DOI:10.29328 / journal.jpsp.1001019

版权许可:©2018年克里斯蒂娜RA, et al。这是一个开放存取物品在知识共享归属金博宝app体育许可下发布的,它允许无限制的使用,分布,在任何介质,和繁殖提供了最初的工作是正确引用。

关键词:细菌性溃疡病;识别;诊断

在墨西哥国家,园艺是一种最重要的农业活动,对外汇收入和就业的一代。在墨西哥,大约512000公顷的蔬菜种植,相当于3.5%的国家农业面积,产生生产八百万吨(吨),相当于9.4%的生产部门[1]。由于小气候和土壤类型的多样性在墨西哥国家,良好的收益中获得49园艺栽培物种,因为可以获得这些产品。在列出的主要作物是土豆、西红柿、洋葱和辣椒,全国最高的消费产品。从所有这些作物的生产,43%是出口,57%是国家消费。在墨西哥生产的作物的国家主要有锡那罗亚,瓜,索诺拉,地方,加利福尼亚半岛,哈利斯科和莫洛雷斯。锡那罗亚的状态生成57%的国家生产成立于80000公顷有89%出口市场[2],这就是为什么它生产的质量标准。

番茄和辣椒是主要的园艺品种在墨西哥国家和州的锡那罗亚。有番茄作物:salladette和球面积30.000公顷。辣椒中作物,出现铃声,墨西哥胡椒,serrano阿纳海姆,加勒比和pasilla;然而前两个是主要作物自1987年以来,在一个区域封闭3.435 288公顷委拉斯开兹et al ., 2008。然而,在因素限制这些蔬菜的生产,有真菌引起的疾病,细菌,phytoplasmas,病毒和线虫,造成巨大的经济损失。增加了植物检疫问题,一定程度上是由于缺乏一个准确的诊断和及时的,这就是为什么农民一直未能妥善处理疾病的影响[3]。

传统上,对症状的观察领域技术人员或种植者,策略来诊断和治疗疾病,而不是最合适的,因为不同的病原体会导致有类似症状的疾病,也可能是由于病原体的组合的非生物因素,如毒性化学物质或土壤中缺乏某些矿物质,等等。在疾病管理的背景下,这个问题需要精确的诊断,这是基本的援助生化、微生物和分子技术。前所述,而番茄作物(Lycopersicon esculentum)和辣椒(甜椒在墨西哥西北部)最具代表性。在索诺拉和加利福尼亚半岛国家,番茄和辣椒蔬菜受到零星的疾病,主要症状的时间。植物保护在墨西哥Departament,注册为检疫疾病的细菌溃疡病的因果代理Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis(Cmm),由于agricol地区的负面影响引起了美国通过种子传播的高容量,通过伤口感染血管组织的能力,气孔和毛状体,产生损失高达85%的作物在适宜的条件下[4]。它复制能力的Cmm引起遗传抗性由于低效率的综合应用[5]。

在墨西哥,特别是在加利福尼亚半岛的状态,这是1994年以来检测到Cmm导致警报。然而,在2006年至2007年的收成季节,再次确认了Cmm在商业番茄和辣椒作物,造成损害发生率40%。之后,在农业领域的索诺拉的状态,发现在2008年和2009年,整流,锡那罗亚仍然保持警惕的状态,因为最后一个状态,是全国代表性区域生产的蔬菜;2015年,国家国内生产番茄994737 .85 t,锡那罗亚的国家参加了28%;符合国家生产的辣椒,476325 .56点t [1]。

植物检疫机构在港口、机场和植物检疫展位发挥重要作用在诊断疾病对进口材料。但是,某些缺陷检测检疫鉴定微生物,主要是由于植物材料的大量进入墨西哥国家[6、7]。锡那罗亚状态,此外,农业农民发现症状类似于细菌溃疡病(Cmm),产生争议生产商对这种疾病的存在与否。另一只手,已经发展到不同的培养基培养Clavibacter种虫害从公式丰富盐水´s解决方案,直到人工培养基的使用;选择一个适当的化学介质是第一步,也是最重要的成功细菌作物。细菌的增长需要不同的因素:物理化学和营养。第一批、光、温度、盐度、pH值、二氧化碳和光周期。秒内大量要素相关,用于合成有机化合物,以及微量元素作为催化剂洛佩兹et al ., 2009。光周期(光照时间)是另一个重要的因素,会影响生命周期和代谢活动的细菌在培养和自然。在自然条件下,大多数微生物是成立于交替的光:黑暗,然而,在大多数的细菌实验室保持不变在作物内部照明,因为它有利于细胞分裂;当他们来使用光周期:黑暗,它是为了模拟自然条件或同步庄稼[8]。

由于以上提到,这是极大的兴趣与以下发展这一研究目标检测的存在Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis在番茄和辣椒种子库利亚坎的农业地区,锡那罗亚,评估的生长和细胞密度Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganenesis(Cmm)在不同的静态选择性培养基连续照明和体外光周期。

实验地点

这项研究是在库利亚坎锡那罗亚的直辖市,墨西哥;研究区位于地理坐标之间:北25°10和南24º00的厄瓜多尔和北部107º43的西方子午线和106º56子午线西经。

这项研究是在两个阶段进行:1)收集使用的辣椒和番茄种子的农民锡那罗亚状态检测使用诊断技术:Cmm)免疫层析法和b) ELISA;b)播种的Cmm在不同的培养基,在连续照明光,光周期12 h: 12 h黑暗,observ Cmm的细胞密度的增长。

第一阶段

种子采集和检测Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis(Cmm)的免疫层析法和ELISA技术(酶联免疫吸附测定):

获取材料的番茄和辣椒种子,实现与的合作公司和法国农业农业农民银行;这些提供了一个数量的100年到150年种子为分析检测Cmm。种子标签、运输均在4°C±2,冷却器的生物技术实验室,然后每个样本存储和冷藏在4°C±2,为进一步诊断植物检疫(7、9)。

Cmm的识别过程,检测试纸技术应用通过后inmunostrips协议识别的埃达等。[9]。Cmm的inmunostrips获得的规模庞大(检测细菌的检疫theagro-producing地区西北墨西哥的12067键)和项目关键USO313002204。这个技巧在于使磨在个人形式收集15个番茄和辣椒的种子和放置在每个包包含缓冲区(SEB4)检测Cmm。样本使用处理砂浆地面完全包。然后,在每袋垂直插入一个抗体的inmunostrips Cmm坚持;水下inmunostrips不超过0.5厘米的阻尼器,为了避免假阳性结果。适合在提到inmunostrips出现两条线,以避免混乱的时候进行诊断:顶部负控制,另一个表示阳性反应的结果。线都体现浸渍inmunostrips三分钟后缓冲区。反应必须发生在30分钟到测试最大。

ELISA试验,该技术进行了考虑协议从Borboa et al。[10],它是基于检测抗原抗体固定在固相使用,直接或间接导致的反应产品,如染料,可以测量spectrophotometrically。根据Borboa et al。[10], Cmm的过程由ELISA检测包括以下步骤:a)致敏的盘子。可靠的诊断分析一式三份。首先,对于每一个样本由抗体的混合物和求职1 x缓冲区,这样做是在一个埃普多夫管抗体混合2 L的缓冲+ 400 L (x的报道。然后加入100毫升水中的全抗体-靠垫的板,允许在一个潮湿在4°C制冷容器在一夜之间。随后进行的第一个洗板是开发洗板1 x PBS-Tween(磷酸盐缓冲saline-Tween),这一过程进行了五次的板在井没有留下任何残留物,然后继续干井卫生纸覆盖,倒过来摇晃风格所有PSBT和浪费。样本然后补充说,第一个浸渍在臼样本(种子),1毫升或提取缓冲要求一般的体积。增加了100 L的研磨样品到每个(两个井),添加了100 uL的积极控制(抗原)积极控制好和100 L的提取缓冲好一般负控制。板被放置在潮湿的容器和孵化一夜之间在4°C。第二盘清洗涉及洗井1 x PBST五倍。 After washing they were cleaned sanitary paper covering them, turning them upside down to that style all remaining PBST and debris that may have been. After this the wells were observed to verify that they were free of plant tissues or bubbles, if they contained one of two obstacles must repeat wash. Later was added the set of enzymes, by adding 100 uL of enzyme solution - buffer ECL (chemiluminescence enzyme) to each well and incubated the plate in a moist container for two hours at room temperature. The enzyme solution - ECL buffer was prepared in an Eppendorf tube by adding 2.5 L of the enzyme + 500 L of ECL buffer 1X. After a third wash was the plate that held 2 h of incubation, then washed the wells of the plate 5 times with 1X PBST. After washing the wells were cleaned sanitary paper covering them, turning them upside down to that style all remaining PBST and debris that may have been. After this the wells were observed to verify that they were free of plant tissues or bubbles, if they contained one of two obstacles must repeat wash. Then the solution was added PNP considered to add 100 L of PNP substrate in each well and the plate was incubated at room temperature humidity of 15 - 45 minutes. After this time the wells were observed to see the results. The positive control should have a bright yellow and the negative should not change color. Wells were observed with the sample to be analyzed, if the wells were yellow and were taken as positive if it changed color were negative. PNP solution was prepared in an Eppendorf tube by adding 500 microliters of PNP buffer 1X + 1 / 6 PNP tablet, diluted by the tablet in the resuspension buffer. It should be noted that the tablets were not touched or exposed to strong light, as this could infer the result of color.

第二阶段

评估治疗的生长和细胞密度Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis(Cmm):

Cmm的细菌生长在培养皿在PDA培养基第一次拟合不同媒体24小时。随后在125毫升Pteri菜培养三种不同培养基在YDC被评估,NBY七天,女子职业高尔夫球协会。中酵母extract-dextrose (YDC)准备10 g的酵母提取物,20 g的葡萄糖,20克碳酸钙(细粉),15克琼脂和1 l的水;NBY琼脂培养基的15克是在营养肉汤8 g, 2 g酵母提取物,2 g钾monohydrogen磷酸(K2HPO4), 0.5 g的磷酸二氢钾(KH2PO4), 2.5 g的血糖和1升的水;而用酵母中女子职业高尔夫球协会根据Rodriguez -蛋白胨琼脂和葡萄糖。每个媒体都暴露在两个条件:1)光周期12 h光(3000勒克斯):12 h七天黑暗和评估;每个文化启动剂50000 cfu /毫升(集落形成单位/毫升)和b)连续光(3000勒克斯)和评估七天,每一个文化启动剂50000 cfu /毫升。文化是保持在控制温度条件下22°C。,十个复制生成每个治疗。

变量监控每12 h

监控的变量有:1。温度,它与传统的水银温度计测量(-10到120°C)。2。pH值,用便携式测量电位计品牌pH值测试仪1伊斯顿,以前校准缓冲为7.0和10.0。3所示。照明与光度计测量费舍尔科学品牌。4所示。量化的细胞密度。这项技术是由直接血细胞计数器的计数深度0.1毫米在10 x和复合显微镜样品固定1% lugol (Gitaitsis et al ., 1987)。细胞浓度的数据转化为获取两个对数基地。 Growth rates (number of divisions per day) and doubling time were calculated by the formula m = (Log2Bn-Log2Bo) / (tn-to). The cumulative growth rate (M) was obtained from all the rates recorded in the experiment (Em) and the maximum rate was the highest M value obtained during the development of crops.

实验设计和统计分析

本研究使用一个完全随机设计方差分析(方差分析)两种方式。我们使用邓肯的多个范围检验P < 0.05的显著性水平检验治疗之间的区别。用于数据分析的统计程序SAS [11]。

第一阶段

据获取植物(种子)的番茄和辣椒Sinaloa州农业土地的农民的,有六个地区的支持(El亚塔马林多,库利亚坎Navolato,库利亚坎,埃尔多拉多和Badiraguato)农民提供种子的品种和混合动力车的检测Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis(Cmm)。应该注意的是,在这六个地区,共有32个业务从事agro-supplies捐赠两作物种子的销售。同时,种植者的数量是225,代表79%的种植者的高和低的库利亚坎地区的规模,锡那罗亚,据Osuna [12];收集到的营养物质是35的番茄品种,而对于辣椒是18岁。

免疫层析法的检测

根据描述的方法来检测Cmm,茄种子结果如表1所示,虽然对辣椒种子如表2所示。可以看出,35种不同材料的番茄,其中只有四个显示Cmm的存在正的,对应于E-9材料,Saladette确定,H4b和皮托种子反复地遭遇,代表收集种子总数的12%和93%的品种在锡那罗亚状态处理。指出,其余的种植者没有提供植物(种子)由于经济成本较高购买一磅西红柿种子($ 5.0153美元)。

就其本身而言,phytopathological诊断为辣椒种子,开发结果的检测试纸技术表明,18材料测试,48%的物品被证明是阳性Cmm的存在。这些材料对应于北部Nunhems卢戈2 / Celdo 942326 BN,功能,3 / Celda 10, Arco F1种子阿纳海姆和不耐烦。这些分析表明,分析了种子是一种细菌性疾病的载体被称为“鸟瞰”[10]。

在开发检测试纸测试是很重要的一点,有变化的响应Cmm的存在,提供了一个积极的结果在不同的时间。这可能是由于细菌的浓度不同,这是反映在一个快速的结果或缓慢,据Agdia [13]。同时,为了确认每个积极识别检测试纸测试Cmm,浸渍的种子(解决方案)的番茄和辣椒,几个额外的测试,包括像播下殖民地在选择性培养基YDC, 28 h后,细菌菌落组成类型细胞杆状细菌,没有观察弯曲形成聚集在一个“V”,殖民地显示变化测量0.4到0.6微米和0.8到1.2微米。同样,测试是形成内生孢子,是负面的。细胞进行显微观察显示没有流动性。这些殖民地YDC上开发时,没有生成的循环和凸殖民地黄色,结果在不同意的戴维斯et al ., (14 - 16)。应该注意的是,免疫反应和一些生理上的反应细菌分离番茄种子的证据,即inmobility在细菌细胞中,殖民地是淡黄色的奶油,考虑负面结果。对于这个变化的结果免疫层析法的考验,被认为是消极的。

革兰氏染色技术,广泛使用的测试,因为它不仅有助于决定细胞的形状(可可、螺旋状菌和细菌),而且该组织的细菌,在这项研究中,执行导致消极的革兰氏染色剂,找到符合Rodriguez [15]。同样,生理测试应用过氧化氢酶获得负面结果,这有助于区分需氧或厌氧细菌;氧化酶试验阴性,有助于区分肠细菌和non-enteric;脲酶试验阳性结果;七叶灵水解测试是积极的;一些测试结果是不一致的与那些被Schaad et al . (17 - 19)。

通过ELISA Cmm检测

根据实验室测试来检测Clavibactermichiganensis无性系种群。michiganensis通过ELISA酶显示明显的番茄和辣椒种子(表1、2)。在表1中,我们可以通过免疫层析法检测一些积极的结果匹配技术Cmm的存在。然而与ELISA相比,这一结果证实了重要性考虑替代诊断技术;这种可变性的结果不同诊断技术根据Fatmi Schaad(20、21),可能会发生,因为细胞的数量等因素,研磨化合物抗体和抗原暴露时间阅读,光、温度等。提供一个相似的结果,可能是条件。然而,建议避免这种类型的可变性(21、22),当时是重复的发展的分析。这方面是解决和确认获得不存在Cmm番茄种子皮托种子材料,反复地遭遇H4B, Saladette Determinado E-9, ELISA。

作为它的一部分,在诊断ELISA结果辣椒种子(表2)表明,只有40%的免疫层析法是感染了Cmm的材料技术。然而,这一结果与ELISA相比不匹配。从这个意义上讲,根据卢et al .,[21],开发推荐三分析,为了证实结果,显示为Cmm的存在是负的。

不是站在上面的结果,由于免疫层析法技术的积极成果,是重要的指示可能Cmm如何有能力的细菌溃疡病通过种子传播(23、24)。这些结果显示了它重要性phytopathological诊断由卫生部门应加强审计人员诊断措施,和环境条件中体现园艺区域用塑料布,是流行病的表达的主要因素自国家1.705公顷种植了西红柿和辣椒在温室,阴凉的房子和露天[1]。

第二阶段。评估治疗的增长和Cmm的细胞密度:一旦Cmm细菌生长在文化媒体YDC NBY女子职业高尔夫球协会,和暴露在两个条件下:a)光周期12 h光(3000勒克斯):12 h黑暗评估变量的温度、pH值和量化细胞密度为七天,结果表明,在这一阶段的研究中,变量温度维持在22°±1.5加元在不同的治疗方法。pH值范围从6.92±0.36,7.19±0.34文化与光周期和6.98±0.29,7.22±0.035文化与连续的光。然而,在这项研究中,观察到的变化根据曼苏尔和结果Salama[25],不是两个条件之间的重要的照明,在此之前一个单位以上,细菌死亡率相当大的[25],方面没有发生在当下的研究。就其本身而言,变量细菌细胞生长培养基,发起的适应阶段,大部分的接种细胞是可行的。然而,观察到二分裂是缓慢的,因为他们不会立即能够分裂[25];后来观察到一个连续的指数增长的细胞,这表明细胞分裂根据Thessen et al。[26]。从这个意义上说,细胞分裂率为常数的四天并记录最大增长速率在文化的第五天。然后细胞复制所需的时间减少,降低增长率,这是一个信号,进入缓慢增长阶段,这个阶段发生在一天的最后一天是6和7文化的增长曲线(图1)。三个不同的媒体和两个光条件有一个类似的趋势,经济增长到实验的最后一天和一个指数阶段扩展主要与光周期中间的女子职业高尔夫球协会。在培养基YDC得到进一步发展,和一定程度上在中NBY,同时观察值降低培养基女子职业高尔夫球协会。 This decrease in growth amid LPGA is because bacteria is adapted to grow with micronutrients near the natural habitat because its vegetable origin, so that the reduction of salts causes there is an increase in cell volume by accumulation of water inside and diversion of their metabolic activities [25] (Figure 1). Analyses of variance indicate that the culture media had a significant effect (P <0.05) on growth rate and maximum cell density of Cmm. The culture medium was obtained YDC higher growth, while the lowest was observed in the middle and LPGA NBY, respectively. The maximum growth rate on YDC was with 1.71 division’s day -1 in the cultures under continuous light and 1.0 divisions day-1 with photoperiod and 1.39 divisions day-1 in the cultures under continuous light at 25 psu (power supply unit). The cumulative growth rate was above three divisions/day for these same media and light conditions, while the other treatments were minor. Thessen et al. [26], mention that the optimal growth in different culture media depends on the species of bacteria because they found thatRalstonia对PDA最大增长速率,而最大增长一半吗Ralstonia王KB (B)和性别表现出增长Pectobacterium介于另外两个属(图1)。分析细胞浓度最高的每个实验手段有显著差异(P < 0.05)的三个文化媒体,发现是高555.000±137.000 YDC cfu /毫升的连续光和453.000±89.000 cfu /毫升与光周期,显著下降(P < 0.05),中(图1)。答案一道细胞培养基对培养基的组件的变化根据不同种类的细菌生长。在目前的研究中,使用的培养基中细胞浓度的下降是一致的罗萨莱斯和莫拉莱斯[27],他发现细胞密度最高的Cmm应变H YDC。与此同时,阿罗约和马丁内斯[28],报告说分枝杆菌生长在实验室控制条件下降低细胞密度意味着更少的富含盐。洛佩兹等。[8]发现Osochrysissp.显示了一个高细胞密度较低浓度的盐,然而,卡斯特罗和射手[29],发现盐没有显著影响(P > 0.05)对经济增长和最大细胞密度Chaetoceroswighamii。文化媒体的变化与不同的营养(盐)影响生物体在三个方面:1)渗透压力直接影响细胞的水势,b)离子的入口或损失造成的压力,离子和c)离子选择性膜的速率变化[25]。除了影响营养物质,光政权也起着重要的作用,因为它也会影响作物的生长和生物量生产[30]。在本研究两个照明条件对最大细胞浓度无显著影响的治疗,但最大增长率(P < 0.05)和累计增长率。光线12 h的光周期:12 h暗增长放缓,找到符合棕色等。[31],报道说Ralstonia的最大增长率1.9连续照明,光周期12 h: 12 h黑暗。另一方面,汉弗莱[32],发现经济增长放缓农杆菌属在12 h光的周期:12 h黑暗文化相比,暴露于持续照明。的硅藻Chaetoceros和Phaeodacttylum didytum tricornutum显示出增长速度下连续光分别为0.6和1.7,0.4和1.2的光周期。

目前的调查我们得出结论的变化来检测Cmm的番茄和辣椒种子免疫层析法和ELISA技术。血清学技术的免疫层析法、ELISA和生化和生理测试,及时phytopathological诊断的有效性识别细菌。因此,建议考虑诊断技术的融合的排放结果。根据不同的文化媒体的评价在Cmm的生长和细胞密度,为了隔离,检测和指数增长的细菌,连续光照条件对Cmm继续提出YDC介质。