临床重症监护和医学杂志》上

ISSN:2639 - 6653

研究文章

评估肌间线蛋白,α-SMA和hTERT表达在肺纤维化和肺癌

Farahnaz Fallahian^{1 *}Javad Moosavi,赛义德·阿里²,Frouzandeh Mahjoubi³萨米拉,大家都会⁴,Pegah Babaheidarian⁵和Tayebeh Majidzadeh⁴

¹肺学和危重病的家伙,呼吸道疾病,伊朗大学医学科学,德黑兰,伊朗
²在肺学教授和急救护理、呼吸道疾病,伊朗大学医学科学,德黑兰,伊朗
³在医学遗传学副教授,博士学位。临床遗传学系、国际遗传工程和生物技术研究所。伊朗德黑兰
⁴医学遗传学博士,临床遗传学系、国际遗传工程和生物技术研究所。伊朗德黑兰
⁵助理教授病理学、病理部门,伊朗Medicall科学大学,德黑兰,伊朗

*通信地址:Farahnaz Fallahian、肺学和危重病的呼吸道疾病,伊朗大学医学科学,德黑兰,伊朗,电子邮件:falahianfff@yahoo.com

日期:提交:09年1月2018;批准:2018年1月22日;发表:2018年1月23日

本文引用:Fallahian F, Moosavi SAJ, Mahjoubi F,大家都会,Babaheidarian P, et al .评估肌间线蛋白,α-SMA和hTERT表达在肺纤维化和肺癌。中国重症监护医学。2018;3:001 - 009。DOI:10.29328 / journal.jcicm.1001011

版权许可:©2018 Fallahian F, et al。这是一个开放存取物品在知识金博宝app体育共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布,在任何介质,和繁殖提供了最初的工作是正确引用。

关键词:间质性肺疾病;肺癌;肺纤维化;端粒酶

有明确的证据表明,环境因素和遗传易感性有助于特发性肺纤维化(IPF)的发病机理。IPF的遗传倾向是明显的家族聚集性和肺纤维化发展在几个罕见的遗传性疾病[1]。

一个10特发性肺纤维化(IPF)患者患肺癌[2]。IPF的肺癌的风险更高,年长的男性吸烟者和有一个肺癌的患病率明显高于IPF和肺气肿综合症与纤维化。此外,常见的表观遗传变化可能代表一个有前途的治疗方法的目标在不远的将来[2]。IPF生成数据机制从流行病学调查以及人体组织细胞和分子的研究。上皮损伤,成纤维细胞激活和重复周期的损伤和异常修复几乎可以肯定关键事件[3]。

Myofibroblasts肺纤维化的发病机制中发挥着重要作用。转化生长因子β1 (TGF)被广泛认为是一个关键的纤维发生的细胞因子[4]。特发性肺纤维化(IPF)的病理特点和其他纤维化肺疾病是成纤维细胞的疫源地,地区丰富的间充质细胞和细胞外基质。肺损伤后成纤维细胞端粒酶活性增加,随后对成纤维细胞端粒酶活性下降可能是重要myofibroblast分化[5]。肺纤维化的一个子集,如角化病congenita,骨髓衰竭,肝脏疾病,代表了一种“telomeropathy”由于在端粒酶和种系突变的特点是短的端粒长度。家庭成员在家族不继承叔突变比控制有较短的端粒长度,证明表观遗传的父母端粒长度缩短置位点[6]。基因突变在端粒酶复杂(叔或,TERC)和短端粒遗传风险因子家族或零星的特发性肺纤维化的发展。多达15%的家族病例和大约5%的散发病例进行杂合的突变的基因,和病人的细胞保持大约50%的端粒酶活性。短端粒即使没有端粒酶突变是大多数特发性肺纤维化患者的一大特色。端粒酶突变也与肺纤维化和肺气肿综合症[7]。 Telomere integrity is mediated by the telomerase complex, a specialized polymerase that adds sequences to the ends of chromosomes [8]. Aberrant telomerase activity has been associated with most human cancers and several premature aging diseases, such as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), a chronic, progressive, and fatal lung disease characterized by alveolar epithelial cell damage and fibrosis [9]. This manuscript evaluates the possible role of α-SMA, Desmin, and TERT expression as markers of lung fibrosis process and early detection of cancer. We tested the hypothesis that expression of markers of fibrosis, and short telomeres in tissues may prone a subject for pulmonary fibrosis or cancer in a spectrum of lung tissues from healthy to fibrosis and cancer.

道德声明

制备的样品保留石蜡包埋肺组织活检,知情同意了从所有受试者或其家庭和批准的研究协议是拉塞尔Akram大学医院的伦理委员会。

病人

我们研究患者的医疗记录拉塞尔Akram承认在医院从2006年到2017年,肺组织活检样本期间检查,被诊断为:肺纤维化[15],肺癌[16],[14]受试者样本正常定义为控制。

完全,包括45人。20(44.4%)是女性和25(55.6%)是男性。他们的平均年龄为54.42±13.236年。肺纤维化组15人,4(26.7%)是女性和11(73.3%)是男性。他们的平均年龄为51.13±16.453年。16个受试者的肺癌组、9(56.3%)是女性和7(43.8%)是男性。他们的平均年龄为60.38±9.905年。14个学科的健康对照组,7(50%)是女性和7(50%)是男性。他们的平均年龄为51.14±10.982年。研究人口的人口特征如表1所示。 Frequency of expression of α-SMA, Desmin, and TERT is depicted in table 2, and Figure 1. Of 16 patients of lung cancer group: 7(43.8%) were adenocarcinoma, 7 (43.8%) were squamous cell carcinoma (SCC), and 2(12.5%) were neuro-endocrine carcinoma. 87.5% of cancers were NSCLC, and 12.5% were SCLC. The mean age of 14 patients in non-small cell lung cancer (NSCLC) group was 9.302±60.93 and the mean age of 2 patients of small cell lung cancer (SCLC) group was 56.50±17.678 year. In SCLC group one patient was male and the other female. In NSCLC group of 14 patients, 6 (42.9%) were male, and 8 cases (57.1%) were female. Paraffin-embedded lung tissue blocks of these patients were sectioned and slides were stained with H&E method. Then sections were immunostained for α-SMA and Desmin, and all reviewed and scored by one pathologist. Alpha SMA was also scored subjectively as 0 (no staining), +1 (mild staining), +2 (moderate staining), +3 (severe staining), and +4(very severe staining). Characteristics of α-SMA score in studied population are depicted in table 3.

一些患者的纤维化病理报告组:

1-Lung组织和间质炎症、纤维化、肺气肿的肺泡

2-Marked间质纤维化

3-Iinterstitial纤维化与肺泡破坏和囊肿形成兼容蜂窝肺

4-Interstitial与囊性纤维化和炎症肺泡(honey-combing模式)5-Chronic炎症和纤维化

5-Chronic炎症和纤维化

6-Interstitial反应性非典型肺炎

7-Interstitial纤维化与慢性炎症和出血有关

8 -弥漫性间质纤维化(弥漫性肺纤维化)

9-Severe间质性肺炎的纤维化和破坏肺泡结构兼容先进的间质性肺病

10-Focal intraparenchymal出血,间质纤维化

11 -严重的急性和慢性炎症,异物巨细胞反应类型与纤维化

12-interstitial肺纤维化

13-Interstitial纤维化与特发性肺纤维化一致

14-Usual间质性肺炎(特发性肺纤维化)

病理报告的一些健康对照组:

1-Bronchial粘膜和肺实质无明显病理改变

2 -肺实质炎症轻微慢性支气管旁的一部分

3-Subpleural印玺随着拥挤的肺实质表明煤肺病

4 -肺活检与气性大疱一致

5-Fragments支气管粘膜和肺实质没有明显的病理改变

6 -符合气性大疱

实验室方法

RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成:从石蜡包埋组织中提取总RNA的纤维化,癌变和正常肺是由RNasy FFPE工具包(试剂盒)根据制造商的指示。RNA溶液纯度和数量是决定通过测量紫外吸收比例260/280 nm使用nanodrop分光光度计。RNA浓度测量后样品我们同步所有样本,个人谁tumor-derived总RNA是不充分评估被排除在外。互补脱氧核糖核酸的合成,1μg从每个样本/总RNA的RNA转录成单链cDNA根据制造商的协议(Frementase)利用低聚糖dT作为底漆。

实时rt - pcr:实时定量PCR是由使用Corbett 6000实时热循环和快速启动DNA主人SYBR-Green我工具包)罗氏应用科学)。Bactin被选为看家基因。引物设计与oligo7软件进行。引物特异性是由爆炸理论上检查数据库和实验证实了积极的控制每个基因扩增。详细的引物信息表4所示。实时RT - PCR是在10μL执行解决方案,包括2μL快速启动主解决方案和0.5μM每个引物的3μL水和4μL互补dna作为模板的放入0.1瓶。热循环由最初的变性步骤95°C 5分钟紧随其后的是一个放大程序重复45周期。

免疫组织化学:免疫组织化学是根据标准协议。3µm-thick formalin-fixed切片、石蜡包埋组织块被准备好,然后安装在带正电的玻璃幻灯片,然后幻灯片在二甲苯deparaffinized 5分钟,两次和水分在100%和96%乙醇分别两次5分钟然后幻灯片在蒸馏水冲洗。抗原进行检索使用柠檬酸钠缓冲(10毫米柠檬酸钠,0.05%渐变20,pH值6.0)和热压处理过的10分钟冷却到室温15分钟紧随其后。幻灯片在1%过氧化氢在室温下孵化抑制过氧化物酶活性,然后幻灯片分别在蒸馏水冲洗和PBS缓冲。幻灯片在室温下孵化了30分钟,沾染了下面的老鼠,反抗体:FLEX单克隆鼠标反平滑肌肌动蛋白(克隆1 a4, DAKO / S)。然后用磷酸盐(PBS) .Subsequently,冲洗的部分受到二次抗体(DAKO真正想象探测系统,过氧化物酶/轻拍):设想(peroxidase-conjugated聚合物骨干,此外,也有二次抗体分子针对兔子和老鼠免疫球蛋白)30分钟。反应产物检测/显示使用/液体涂+显色系统。然后幻灯片与PBS缓冲液冲洗5分钟,洗净浸泡在蒸馏水和复染色幻灯片幻灯片在苏木精为30秒。脱水酒精的组织通过4更改幻灯片(95%,100%),每个5分钟。最后免疫染色反应进行评估与光学显微镜的病理学家。

结果描述为均值±SD和连续变量的范围。同时,频率和百分比的分类变量或行号报告百分比。确切概率法被用来确定分类变量之间的关系。统计检验显著性水准为0.05。24 SPSS软件版本是用于统计分析。

肺纤维化组和健康对照组进行比较

性,在健康对照组,有7例(63.6%)女性和男性7例(38.9%)。在肺纤维化组,4例(36.4%)受试者女性和11(61.1%)是男性。这不是任何组织性别的区别。α-SMA发现1例(8.3%)的健康控制样品和in11(91.7%)的肺纤维化。确切概率法的统计组差异显著(p < 0.001)。在没有一个健康的控制肌间线蛋白是积极的,但这两个样本中,检测出的肺纤维化。两组之间没有显著性差异(P = 0.157)。叔并不表示在任何情况下的健康对照组,但它是积极的在肺癌组7例(100%)。的确切概率法,这是一个群体之间的显著差异(P = 0.005)。

比较肺纤维化和肺癌组

在纤维化组4(30.8%)是女性和11(61.1%)是女性。在肺癌9例(69.2%)是女性和7(38.9%)是男性。这是两组性别之间没有显著差异。

在肺纤维化组,α-SMA标记是积极的在11(44.0%)和积极在肺癌组14例(56.0%)。两组之间没有显著差异,确切概率法(P = 0.318)。

肌间线蛋白中检测出2(100%)的肺纤维化,但并不是在任何情况下发现肺癌。两组之间没有显著差异,确切概率法(P = 0.131)。实时rt - pcr结果显示,hTERT并不表示在任何情况下肺纤维化,但表现在7(100%)的肺癌。两组之间有显著差异的确切概率法(P = 0.004)。

肺癌和健康对照组进行比较

14名健康对照组7(50.0%)是男性,7(43.8%)是女性。在肺癌16:9例(50.0%)受试者男性和7(56.3%)是女性。这不是任何组织性别的区别。α-SMA是阳性1例(6.7%)的健康对照组和14个(93.3%)的肺癌组。Fisher精确检验组之间差异显著(P < 0.001)。

叔并非在任何情况下积极健康的对照组,但积极在肺癌组7例(100%)。的确切概率法,这是一个群体之间的显著差异(P = 0.005)。

比较肺癌的类型

叔标记是积极在SCLC组1(14.3%)和6(85.6%)的患者的非小细胞肺癌组。与确切概率法的差异不显著(P = 0.700)。SCLC组α-SMA是积极的在2(14.3%),而在非小细胞肺癌是积极的在12个(85.7%)、(P = 0758)。并没有显著的差异。分布的频率α-SMA和叔肺癌类型如图2所示。hTERT表达分析在肺癌实时RT PCR是如图3所示。

突变基因编码端粒酶(叔和TERC)可能导致IPF通过缩短端粒长度和疲惫的肺干细胞。两个看似不相关的生物通路的分子数据:肺泡上皮细胞内质网压力和端粒酶功能障碍开始阐明IPF的发病机制[10]。在我们的研究中,发现α-SMA样本中肺纤维化和肺癌,我们建议随访肺纤维化病例可能罹患癌症的风险。然而,叔表示只是在7肺癌样本。我们的研究建议关于α-SMA和肌间线蛋白,端粒长度进行评估和治疗肺纤维化,目标和肺癌。然而,另一项研究[11]提到,肺纤维化的发病机制是独立于染色体端粒的长度。在[12]的一项研究中,研究骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)在6特发性肺纤维化(IPF)患者中,7类风湿性关节炎患者相关的间质性肺炎和6健康对照组。他们展示了相同的端粒长度和端粒酶表达BM-MSCs IPF和RA-UIP这就可以解释相似的发病机理及预后[12]。肺癌的患病率IPF患者(4.8%对48%)远高于没有IPF患者(2.0%到6.4%)。肺癌通常发生在外围肺纤维化的变化是主要的区域。 The underlying mechanisms of the development of lung cancer in patients with IPF have not been fully understood, but may include the inflammatory response, epithelial injury and/or abnormalities, aberrant fibroblast proliferation, epigenetic and genetic changes, reduced cell-to-cell communication, and activation of specific signaling pathways [13]. According to a review [14], review: A recurrent global theme is that many microRNAs studied in IPF are both regulated by transforming growth factor β1 (TGFβ1) and regulate TGFβ1 signaling pathway by their target genes. The changes in microRNA expression in the IPF lung and the evidence for their role in the fibrosis suggest that microRNAs should be evaluated as therapeutic targets in IPF [14]. In a study in Central Denmark, IPF was the most frequently occurring interstitial lung disease (ILD) (28%) [15]. Telomerase dysfunction has been associated with both fibrogenesis and carcinogenesis (16). A study (16) aimed to evaluate the telomerase mRNA expression levels of both subunits (h-TERT and h-TERC) in lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) from patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and non-small cell lung cancer (NSCLC), since there are indications of common pathogenetic pathways in these diseases. According to that study [16], both h-TERT and h-TERC mRNA expression is down regulated in lung tissue from patients with IPF compared with healthy controls. Telomerase is expressed in most human cancers, including lung cancers. As in many other cancer types, lung cancer cells avoid the progressive attrition of telomeres by expressing telomerase. Using a polymerase chain reaction based telomeric repeat amplification protocol assay, early studies reported finding telomerase activity in most primary lung cancer samples [17-19]. Furthermore, several studies using animal models and human non-small cell lung cancer )NSCLC) tissues have reported that TERT mRNA and TERT protein are overexpressed in lung cancer biopsies compared with normal lung tissues [17,20,21].

上皮间充质转变(EMT)是一种复杂现象的特点是收购的标记成纤维细胞和myofibroblasts如α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)和N-cadherin和上皮标记包括钙粘蛋白的损失导致上皮细胞的转化成一个能动的间充质细胞[22]。EMT是上皮损伤和纤维化的重要机制在一些组织(22 - 24)。EMT过程中,上皮细胞的细胞连接丢失,提高骨骼,将细胞转换成纺锤波从多边形形状和获取入侵属性由于极性和粘结力的损失。此外,许多信号分子EMT被认为是癌的起源有关。这些现象表明EMT过程与上皮细胞恶性转化和转移epitheliogenic肿瘤(22、25)。在我们的研究中,发现叔表达式在某些肺癌患者,但没有显著差异在非小细胞肺癌和小细胞肺癌肺癌叔的表情。

之间的显著差异表达的α-SMA健康对照组和肺纤维化可能α-SMA标记被视为纤维化倾向的标志。之间的显著差异表达α-SMA和叔在健康控制和肺癌,可能实现这些癌症易感性标记。我们推荐更多的调查把α-SMA,肌间线蛋白患者的纤维化和跟随他们可能患癌症的风险。还需要更多的研究来作为叔肺癌的一个标志。评估这些标记可能未来的含义解释相同的纤维化发病机理和致癌作用和癌症预防或治疗。

谢谢你的统计人士Sheikhvatan和Atefeh Talebi教授的支持。