兽医科学见解

ISSN:2576 - 9510

研究文章

用逆转录-聚合酶链反应的微分检测犬瘟热病毒在智利的两个血统

玻利瓦尔P¹,德斯PF²和纳瓦罗C^{1 *}

¹动物预防医学部门,兽医和动物科学学院,FAVET,智利大学、智利
²肯尼迪学院的风湿病。英国牛津大学

*通信地址:纳瓦罗C,动物预防医学部门,兽医和动物科学学院,FAVET,智利大学,智利,电子邮件:carnaven444@gmail.cl;canavarr@uchile.cl

日期:提交:2019年2月18日;批准:2019年3月01;发表:2019年3月04

本文引用:玻利瓦尔P,德斯PF,纳瓦罗c使用逆转录-聚合酶链反应的微分检测犬瘟热病毒在智利的两个血统。兽医科学的见解。2019;3:005 - 013。DOI:10.29328 / journal.ivs.1001014

版权:©2019玻利瓦尔P,等。这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,金博宝app体育它允许无限制的使用,分布,在任何介质,和繁殖提供了最初的工作是正确引用。

关键词:rt - pcr;血凝素;H基因;America-1;欧洲第一/南America-1;犬瘟热病毒。

犬瘟热病毒(CDV)感染是最严重的传染病之一,在狗和其他食肉动物,multi-systemic、高度传染性和全球负担。造成的病理CDV有变量根据物种,发病率和死亡率可超过50%在雪貂在狗和90%。作为一个单链和消极意义上病毒RNA基因组CDV分类Mononegavirales秩序内,副粘病毒科和麻疹病毒属。值得注意的是,尽管CDV单一抗原类型(即血清型),迄今为止全球有超过14个不同血统被描述。血统的决心一直在基因编码病毒糖蛋白,主要的血凝素(H)基因的分析是其中一个最信息由于其较高的遗传变异性。

CDV提出了高取向淋巴、神经上皮组织,导致多系统感染影响消化、呼吸系统和中枢神经系统。因此,与疾病相关的临床表现是广泛的,包括最频繁hyperqueratosis鼻子和脚架,黏脓性的呼吸道分泌物,呼吸困难、广义lymphoadenopathy,腹泻、肌阵挛发作。由于大量的临床表现,需要有实验室诊断工具,允许确认病毒的存在。目前,有几种技术,如免疫荧光,ELISA, rt - pcr等,来实现这个目的。传播病毒的rt - pcr促进了识别血统,比如智利的两个特征即America-1和Europa-1 / Sudamerica-1。

因此,我们开发了一个rt - pcr技术能够检测和区分这两个普遍的血统通过设计基于官方核苷酸引物序列存入基因库®。通过这种方式,我们能够描述临床病毒毒株,以证实其遗传谱系和评估其他CDV血统是否在中国传播的负面检测。后者的选择将打开另一个犬瘟热病毒血统的选项,不确定,在这个国家。

病因犬瘟热的病毒

CDV病因代理导致CD。它属于属麻疹病毒,Mononegavirales家庭Paramixoviridae和秩序。作为一个包含脂质包膜病毒膜浓缩在感染宿主细胞所需的糖蛋白,CDV是一个非常不稳定的环境,容易受到大多数消毒剂。它包含一个不分RNA基因组的负极性和有六个六个结构蛋白基因代码出现在感染性病毒颗粒(病毒):基质蛋白(M);血凝素(H)和融合蛋白(F),这两种糖蛋白参与绑定和感染的靶细胞。同时,CDV编码三种蛋白质参与病毒基因组的复制和转录病毒蛋白在感染的靶细胞:磷酸化蛋白(P),大依赖RNA的RNA聚合酶(L)和核衣壳蛋白(N),病毒基因组的包装形式核糖核蛋白复合物[1 - 3]。

血统

H基因,编码的表面糖蛋白血凝素最麻疹病毒属的物种基因异质性,因此,测序被用于病毒株的鉴定。CDV内血凝素的氨基酸变异株中达到10%。这种可变性和H的系统发育分析蛋白质,使得不同的定义CDV遗传血统流传全球[4]。迄今为止,14个循环血统的CDV描述:Africa-1;Africa-2;America-1;美国;Asia-1;Asia-2;Asia-3; Asia-4; Europe-1 / South America-1; Europe-2 (wild European); Europe-3 (Arctic); Rockborn-like; South America-2; South America-3 [5-8].

流行病学

CDV具有广泛的宿主致病。其中,我们可以提到许多家庭的秩序食肉类,如犬科动物(狗和狐狸),猫科(野生猫科动物),鼬科(雪貂和水貂),以及鳍脚目总科,一些鲸类和日本的灵长类动物,这将导致一个严重的威胁全球濒危物种的保护。在世界范围内,这种疾病非常普遍也有高发病率和死亡率,这在食肉动物之间的差异广泛[9 - 11]。

在智利,CD爆发正式报告的狐狸和狗Coquimbo地区和鲁宾逊岛,分别。后者的情况下生成的巨大潜在风险的担忧蔓延的双头狼胡安费尔南德斯(Arctocephalus philippii)保护、濒危物种(12 - 14)。

发病机理

CDV高度传染性,可以输入一个易感宿主通过鼻腔或口腔的路线,从口鼻分泌物或尿液从受感染的动物。在数小时内的感染,CDV目标免疫细胞表面表达CD150启动其复制,如肺泡巨噬细胞和/或呼吸道的树突细胞。这些感染细胞通过淋巴系统和血液传播病毒,建立主要细胞相关感染后病毒血症3至6天。感染后10天,随后病毒血症导致CDV传播向多个系统的上皮组织,包括免疫、神经和上皮组织,引起各种临床症状相关的损失函数受影响的系统(11、15、16)。后,重要的是二次病毒血症,如果宿主抗病毒免疫反应失败在控制CDV传播,病毒到达中枢神经系统(CNS),造成神经系统疾病的表现。次数少,泌尿生殖疾病,心脏和皮肤系统也观察[11]。CDV利差在所有分泌物和排泄物后5日内感染,出现临床症状。传播可以持续3到4个月,但通常持续1 - 2周[15]。

疾病的临床表现

犬瘟热的临床体征狗非常不同。其严重程度、持续时间和表示取决于动物的年龄,其免疫状态和菌株的毒力,以及伴随的与其他病原体感染。在第一个实例中,动物将出席与淋巴细胞减少、瞬态发热和免疫抑制。在第二阶段的病毒血症,各种临床表现将根据受影响的组织。然而,第一临床症状表现为嗜睡,脱水,厌食症和减肥(11、15、17)。

狗有呼吸道妥协可能存在双边鼻浆液性黏脓性的放电,结膜炎和非生产性的咳嗽。肠道感染导致胃肠道上皮破坏,因此,食欲不振,呕吐、腹泻、电解质异常,伴随观察脱水(11、15)。

神经是进步的迹象,将取决于病毒在中枢神经系统内的分布,包括感觉过敏、肌阵挛、癫痫、眼球震颤、共济失调、麻痹或姿势赤字。在更长期的方式、皮肤和眼部症状可以观察到,如脓疱性皮炎、足底垫和鼻上皮角化过度,葡萄膜炎、脉络膜视网膜炎和干性角膜结膜炎(11、15、17)。

疫苗接种

疫苗接种是控制这种疾病的主要策略,用减毒活病毒疫苗和重组疫苗开发。免疫的发生率大大减少CDV家犬的人口,然而,疾病的暴发已观察到全世界的狗接种疫苗。尽管这些事件的原因尚未确定,疫情可能解释为一个足够的疫苗病毒的衰减,由人类错误(错误的疫苗接种计划,疫苗管理不足,可怜的存储或处理的),或通过基因变异的病毒(菌株能够躲避疫苗诱导的免疫反应)(5、6、15、18)。

诊断

CDV感染的确诊应根据疾病的临床表现和标志的识别与多个系统的参与和历史有关的风险,如接触受感染的狗,缺乏疫苗接种或不当的犬只免疫并发症(15、19)。

然而,有必要建立一个实验室诊断方法确认病毒的存在和排除其他疾病相似的临床表现[20]。一些诊断技术包括病毒隔离,直接免疫荧光,ELISA检测特定的IgM对CDV和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr) [15、17]。

逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

rt - pcr技术允许病毒基因变异的研究,通过基因组序列的分子特征。由于这种技术,它可以识别不同的血统流传全球和在智利,主要通过分析H基因的病毒[17]。在这种背景下,一个多重rt - pcr的协议是在网上使用引物设计开发能力的检测和区分America-1和欧洲第一/南America-1血统。因此,我们试图创建一个诊断工具对患病率的流行病学研究通知也有用两个血统。这种方法还允许我们评估的存在额外的血统,每当一个已知的正样本通过其他方式出现负后,我们的分析表明,另一个循环CDV的血统,没有描述,存在于这个国家。

材料和方法

目前的报告进行了滤过性微生物学和微生物学实验室部门的预防兽医学院动物医学和动物科学的智利大学。

引物设计

对引物的设计血统,H基因的系统发育树CDV Ke et al。[21],描述,使用编号为11的访问官方核苷酸序列的血统。America-1和34官方核苷酸序列的欧洲第一/南America-1血统,存储在基因库数据库收集的(附件1)。然后分析核苷酸序列的身份使用ClustalΩ在线项目获得守恒的共识区域被用于每个血统的引物的设计。这个设计使用的免费的在线程序Primer-BLAST国家生物技术信息中心,考虑到游击队必须具有某些特征,这是:有一个胞嘧啶、鸟嘌呤碱基的比例接近50%;引物的扩增子片段通过每一对不同的大小;每一对的熔化温度的差异不是大于3°C;而这两对引物的熔点是类似的。

后获得理想的一对引物对于每个血统,他们的序列与其他组件的每个序列家族的CDV H基因。此外,他们对其他序列的序列进行调查爆炸在线程序,每一对引物的特异性可以确定。引物的序列被送到公司合成Fermelo®和与P1: 5“-CTATTG CATCGGCAGCAAATC-3”和P2: 5“-CCCAGTGTCACTACTAGAATA CC-3”的检测America-1血统,引物,扩增DNA片段的约478个碱基对(bp)(附件2)。而序列合成的检测Europa-1 /南America-1血统与P3: 5“-ACCTTGCTTGCTATCACTGG-3”和P4: 5“-GCACCATCCAGGT TGCTATT-3”,这使得放大DNA片段的约940个碱基对(附件3)。

样品

分析,20 N基因的病毒RNA阳性样本国家孤立的CDV使用不知道他们所属的家族,都储存在-20°C的病毒学和微生物学实验室的智利大学的兽医学和牛。

积极控制rt - pcr反应,RNA提取两个阳性样品用于检测CDV H基因通过rt - pcr[22],随后积极rt - pcr检测的N基因[20]。其中一个样品测序,确定在America-1血统,而另一个是测序和确定在欧洲第一/南America-1血统[22]。

作为一个控制的多个检测引物,混合物的RNA积极控制用于上述America-1和欧洲第一/南America-1血统。负控制,从血液中提取RNA与抗凝剂(EDTA)使用两只狗无风险的历史和临床症状的疾病,没有接种疫苗和其他疫苗接种时间表每天消极的rt - pcr基因n Nuclease-free水用作试剂控制。

rt - pcr技术的实现

热循环。执行rt - pcr技术,一个阿波罗(美国CLP) thermocycler使用了96口井为0.2毫升。rt - pcr协议是详细的下面。

反转录。我们使用25μL上标rt - pcr一步工具包的白金Taq DNA聚合酶”(Taq DNA聚合酶,MgCl2和三磷酸脱氧核苷酸),5μL模板的RNA和5μL每个特定引物(0.1 - 0.2μM),获得50μL最后一卷。引入热循环仪的混合物后,逆转录步骤执行根据制造商的指导方针,这是第一阶段在45°C 30分钟逆转录酶的性能,然后一个阶段在94°C 2分钟为酶的变性。

DNA扩增。DNA变性的PCR技术思考阶段,其次是对齐的初学者阶段和最后阶段的伸长来完成一个循环。DNA变性阶段在94°C进行了30秒。在调整阶段,一个温度53°C用于30秒,根据确定的熔化温度对初学者(约58°C)。72°C的伸长阶段考虑温度一分钟。40个周期后,我们开始最后一个在72°C扩展阶段8分钟,然后我们继续放大产品的可视化在TAE缓冲区使用2%琼脂糖凝胶电泳。确证的预期扩增子大小我们使用AccuRuler 100 bp + DNA梯(Maestrogen®)。电泳是在90伏45分钟然后,凝胶是孵化与溴化乙锭(0.5μg /毫升)30分钟,可视化的DNA带紫外线透照器,随后拍照。

核苷酸序列的条目定义的访问数据(附件2)ClustalΩ程序允许获得公共区域(表1,星号)America-1血统和欧洲第一血统。/南America-1 VDC H基因。

设计引物的欧洲第一/南America-1血统,共识序列进入NCBI第一次爆发的在线项目是那些30多核苷酸的共同点和差异与韩国美国血统的至少25核苷酸。然后,获得的序列比较的其他组件的每个序列血统VDC H基因,除了进入爆炸在线项目。这种策略帮助我们确认每一对引物的序列设计针对他们的血统。核苷酸序列的血统America-1和定义对应于478个基点的扩增子:P1: 5“-CTATTGCATCGGCAGCAAATC-3”和P2: 5“-CCCAGTGTCACTACT AGAATACC-3”。而序列合成有关欧洲第一/南America-1血统和原始的扩增子940个基点是:P3: 5“-ACCTTGCTTGCTATCACTGG-3”和P4: 5“-GCACCATCCAGGTTGCTATT - 3”。在图1中可以观察乐队起源于rt - pcr反应的控制,明确乐队在哪里观察到的情况下积极控制每个血统的。没有观察到的乐队在消极的控制或试剂控制(即。:无核酸酶的水)。分子标记大小从100年到3000年,英国石油公司作为参考。

所有的样品分析的反应只有血统的一对引物设计America-1(图1、2)。

CDV仍然是一个常见的问题,不仅在兽医实践,而且在保护濒危物种。这是一个非常普遍的疾病,非常会传染的,而且许多易感宿主。此外,虽然有疫苗保护动物的疾病,CDV疫情仍在观察接种疫苗的狗。应该提到在智利准备使用的疫苗病毒株属于血统America-1,描述的两种血统的国家之一。根据文献咨询,没有流行病学研究的流行欧洲第一/南America-1血统在智利,这将是有趣的情况下探索从一个重要的部分在国内与CDV狗接种疫苗由于病毒毒株属于欧洲第一/南America-1血统。

因为样品的分析,这是观察到的20个样品分析America-1血统是积极的。这些被冷冻,可追溯到2011年,所以这将是有趣的继续分析其他当前样本,了解以更大的确定性的流行欧洲第一/南America-1血统。

本研究中使用的示例是一个积极的控制为欧洲第一/南America-1血统对应于外周血样本从有症状的狗获得证实感染CDV通过ELISA试验检测CDV-specific IgM抗体。这是进一步进行rt - pcr检测的CDV H基因测序,对齐和隔离在欧洲第一/南America-1血统。病人是一个混血儿女性大约1年,已接种疫苗对CDV和提出了一个神经疾病的表现在2011年。它将需要收集更多的信息关于这个病人,如旅行史,这可能有助于了解其蔓延的欧洲第一/南America-1血统。在这种背景下,这也将是有趣的知道进行日常管理,例如,分泌物的管理。因此,有人可能会认为如果保持良好的护理,这一病毒无法进一步蔓延和血统的发现是偶然的。

目前,rt - pcr技术H基因不被认为是最好的诊断替代疾病由于其高遗传异质性。然而,不同血统的诊断必须进行基于H基因的分析,优化,要分析的样品CDV是积极的。本研究确定的既定的条件下,每个家族的引物的设计是有效的,所以可以认为是一个有用的诊断工具的流行病学研究。

在这个工作我们试图设计为每个血统最合适的引物,将独家和每一个选择,考虑他们应该的特征,用于多重rt - pcr技术。然而,一些血统有很多相似之处,是欧洲第一的情况下/南亚America-1和美国血统。在这里描述的设计寡核苷酸,引物的比较阶段与其他血统被认为是获得。出于这个原因,这将是有趣的其他CDV血统,获得样本等,例如,韩国美国血统,为了验证每个家族的总选择性引物。应该提到在rt - pcr技术,调整阶段的引物进行了在一个温度和结果优化不再需要应用一个梯度的退火温度。最后,它将会是很有趣的了解最近所描述的系统发育树的存在,连同这个文献支持,能够建立更新核苷酸身份地区。

根据获得的结果建立的rt - pcr协议后,观察,设计引物能够充分意识到他们与高特异性相关的血统。样品的分析表明,America-1血统都是积极的,这表明它是主要的血统流传。更大的调查临床分离株的CDV需要确认这个观察和开展流行病学研究来确定真正的流行欧洲第一/目前在智利南部America-1血统。这项工作已经导致一种技术能够支持这些流行病学研究。

附件