在临床和细胞免疫学的见解

ISSN:2640 - 2793

研究文章

协会的toll样受体2、4和9基因多态性与高海拔诱发血栓形成患者在印度人口

斯瓦特•沙玛^{1 #}来发现Garg^{1 * #},吉奥莉•米希拉²Babita Kumari¹,莉莉赶车¹和Bhuvnesh库马尔¹

¹国防生理&联合科学院Timarpur德里,印度
²友好大学,诺伊达,印度
^#并列第一作者

*通信地址:来发现Garg基因组学部门,国防生理和盟军科学研究所,勒克瑙,Timarpur,德里,印度,电话:91-11-23883190;传真:91-11-23914790;电子邮件:iti219@gmail.com

日期:提交:2019年1月10日;批准:07年2月2019;发表:2019年2月08

本文引用:Sharma年代,加戈,Mishra G, Kumari B,赶车,等。协会的toll样受体2,4,9基因多态性与高海拔诱发血栓形成患者在印度人口。观察细胞Immunol。2019;3:006 - 015。DOI:10.29328 / journal.icci.1001008

版权许可:©2019 Sharma年代,等。这是一个开放的文章在知识共享归属许可金博宝app体育下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。

关键词:静脉血栓栓塞;通常;单核苷酸多态性;基因分型

静脉血栓栓塞(VTE)广泛的特征是多因素的疾病,与许多继承和获得诱发因素[1 - 3]。在高空缺氧,一个独特的环境条件被说成是后天的静脉血栓栓塞的危险因素,因为它容易使健康人静脉血栓形成。有各种各样的报告给了解深静脉血栓形成(DVT)的发生率和肺栓塞(4、5),门静脉血栓形成[7]和脑静脉血栓形成在高海拔的地方[7][8]。Anand et al .,有报道称,长期呆在HA与血管血栓形成的风险增加30% [9]。仍然低氧诱导静脉血栓形成的潜在的分子机制并不完善。年度全球发生静脉血栓栓塞的发生率是每款6 - 29人在不同人群中[10]。然而,在印度人口很少的发生率已报告主要是因为缺乏流行病学数据的静脉血栓栓塞[11]。的静脉血栓栓塞风险影响因素包括遗传突变基因参与凝血和纤溶途径。也建立了突变基因的pro-coagulant或抗凝也相关的静脉血栓栓塞的风险(12 - 15)。慢性局部或全身性炎症的发生是由于各种心血管疾病包括静脉血栓栓塞的表现。 The pro-inflammatory molecules like cytokines and chemokines mediate this inflammation. However, the role of mutations in genes involved pro-inflammatory pathways is not well elucidated for VTE. There are new studies indicating that hypoxia is associated with inflammation [16,17]. The primary receptors of innate immunity are Toll-Like receptors (TLRs) and they can be a possible thread linking hypoxia and VTE by recognition of damage associated molecular patterns (DAMPs) generated by hypoxia. There are several lines of evidence showing TLRs links innate immune defence interaction with pro-inflammatory pathways that in turn affects the occurrence of diseases The various cells and tissues of cardiovascular system expresses TLRs on their surface [18]. There are various studies on SNPs analysis of TLRs conducted on western population that show that TLRs are involved in development and progression of diseases like atherosclerosis, thrombosis, congestive heart failure and cardiac dysfunction in sepsis etc. [19-22]. There are 11 TLRs that has been identified and cloned in humans. The number of studies related to different TLR polymorphism and their susceptibility to cardiovascular diseases is limited. The most widely studied TLR SNPs involved in CVDs are of TLR 2, 4 and 9 genes in western population. TLR2 A2258G (rs5743708) has been studied for association with Coronary restenosis [19], TLR4 A896G (rs4986790) for Atherosclerosis [20], and carotid artery atherogenesis [21] and TLR9 T-1237C (rs5743836) for Deep vein thrombosis, atherogenesis or restenosis [22].

SNP基因的存在可能会影响或改变蛋白质编码的基因的结构。在本研究,我们旨在观察TLR的各自的SNP对蛋白质结构的影响2、4和9通过使用生物信息学工具。蛋白质结构的变化会影响信号的识别受体,因此对疾病的敏感性。此外,我们还分析了协会TLR基因的单核苷酸多态性(SNP)与诱发个人静脉血栓栓塞的风险,通过研究基因多态性TLR2 (rs5743708), TLR4 (rs4986790)和TLR9识别(rs5743836)基因在高海拔(HA)血栓形成患者健康受试者相比。

蛋白质结构分析

TLR2的蛋白质结构,TLR4和TLR9识别野生和突变窝藏SNP即TLR2 (rs5743708), TLR4 (rs4986790)和TLR9识别(rs5743836)是模仿使用猛禽X程序[23]。能量最小化是通过使用Swiss-Pdb观众[24]。结构可视化使用PyMol (www.pymol.org)。结构验证使用ERRAT (http://services.mbi.ucla.edu/ERRAT/), ProSA [25,26], PROCHECK[27]和证明。表面形貌和口袋被估计使用CASTp[28],提供见解与蛋白质相关的属性。结晶和蛀牙是决定使用ProFunc [29]。这些地区从功能方面是很重要的。结晶的面积和体积是重要的交互确定残留物,配体和受体结合。产生的突变体是使用I-Mutant 3.0提供的细节各自稳定性[31]。DDG值小于零的象征的稳定和减少超过0指定增加稳定性。 Channels in the protein structure were determined using beta cavityweb [31].

研究人群

25男性病人诊断为高海拔诱发静脉血栓栓塞不到45岁,住院的血液学,军队医院研究和推荐(AHRR),德里(三级护理单元),和四十健康、年龄和sex-matched志愿者接近同意参与这项研究。所有的参与者在研究的病史询问。排除标准后排除参与者与病史的静脉血栓栓塞的风险本身或其近亲属对照组。受试者在病人组,临床资料数据的文档以及日期,和网站的静脉血栓形成(VT)集的存在诱发因素(如手术、创伤、长时间固定,高血压、糖尿病、家族性出血)的历史。排除标准病人组随访排除参与者记录的系统性疾病。所有患者的诊断证实的至少一个辐射或神经成像方法像彩色多普勒超声造影ct /计算机断层扫描血管造影和磁共振成像。这项研究是人类伦理委员会批准的机构国防生理&盟军科学研究所对贾尼符合ICMR指导开展。

血液采集

外周血样本收集所有科目的真空采血管管(美国新泽西州Becton和Dickinson) K2EDTA抗凝。血液收集用于DNA隔离(用于pcr分析)。获得的DNA是储存在-20 oc直到使用。

基因分型

QIAamp DNA隔离设备(试剂盒、德国),根据制造商的协议是用于隔离从外周血中收集的高分子量DNA EDTA真空采血管。确定基因组DNA浓度NanoDrop 2000分光光度计(美国热费希尔科学)使用。DNA样本(100 ng / mL)加载在1%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭和电泳半个小时为了视觉效果在凝胶成像系统(融合FX5 Vilber Lourmat,法国)的定性分析孤立的DNA。特定的基因序列TLR2 A2258G (rs5743708), TLR4 A896G (rs4986790)和TLR9识别t - 1237 c (rs5743836)区域放大使用特定的引物序列。最后的聚合酶链反应(PCR)含有100 ng DNA, 10 pmol每个正向和反向引物和1 x红色Taq DNA聚合酶缓冲(西格玛奥德里奇,美国)。PCR扩增产品与特定的限制性内切酶消化的最佳温度。消化样本加载在2 - 3 %琼脂糖凝胶含有溴化乙锭和受到凝胶电泳带不同的大小。凝胶电泳实验在室温下进行,和乐队被认为在紫外线下。消化产品的等位基因的大小测定分子量标记比较起来。特定的等位基因的存在证实了存在与否的消化。 Positive control and negative control i.e. SNP positive sample with known profile and SNP negative sample (blank) respectively were used in each experiment for verifying results. Complete details of PCR conditions and genotypes screened for different genes are listed in table 1.

统计analysisGenotypic和等位基因频率是由基因决定的计算和比较了2 x2列联表。统计学意义的患者组和对照组之间的差异被x平方分布检验估计,确切概率法和计算奇怪的比例(95%置信区间)使用图垫(棱镜)。统计显著性标准对所有测试p < 0.05。

血栓形成可与炎症有关的概念已经被彼得说[32]。炎症诱发血栓形成是行之有效的,但还是其发病机理尚不清楚。炎性分子如细胞因子、趋化因子链接炎症和止血。血栓性状态可以发生在身体由于炎症往往抑制纤溶活性天然抗凝通路和增加pro-coagulant因素。血管内皮受损的慢性炎症,血管扩张性属性,可能会引起损失的生理抗凝,anti-aggregatory效果。静脉血栓形成也可以包含在缺乏血管壁的炎症损伤到三十五。

通常是家庭的模式识别受体同源免疫细胞中差异表达哺乳动物[36]。他们启动信号转导通路通过认识和绑定到守恒的分子模式(pamp)的微生物或其有关分子模式(抑制)。之后,通常有激活的触发信号转导途径,导致树突状细胞的成熟和细胞因子的生产[37]。通常扮演着重要的角色在激活先天免疫[38]。有越来越多的证据,强调特定的单核苷酸多态性(snp)的影响TLR基因,细菌和病毒感染的调制器。然而,炎症之间的确切关系,先天免疫和血栓形成仍是初级阶段。证明是否发炎导致血栓形成的发病或进展,我们检查是否一个本构缺陷在先天免疫反应发生在通常的形式多态性是否与降低血栓形成的风险。评估这个首先我们分析了各自的SNP对蛋白质结构的影响的TLR2 TLR4和TLR9识别在网上方法。其次是基因分型研究与HA-induced血栓形成。

突变TLR2蛋白结构的影响

苏格兰民族党rs5743708 TLR2对应Arg753Gln突变的蛋白质结构。野生型TLR-2包含122个口袋的变异减少到119人。口袋里的体积和表面积增加突变(表2)。从15频道的数量减少野生11突变蛋白(表3)。自由能的差异的突变(DDG)使用I-Mutant计算是-1.38千卡/摩尔由于Arg753Gln TLR2。比野生TLR2突变是热力学不稳定的蛋白质。这意味着突变蛋白转导将减少下游信号从而使特定疾病的突变表型的保护。图1,图2描绘了突变体和野生TLR2蛋白质结构的变化。

在TLR4突变蛋白结构的影响

突变rs4986790对应Asp259Gly改变蛋白质和导致减少口袋的数量从119年的114的野生型蛋白突变(表4)。然而,没有改变观察频道数量的突变。只有孔隙的表面积减少突变(表5),DDG突变值对应于-0.92千卡每摩尔。I-Mutant结果进一步预测不稳定的突变对野生型蛋白。根据这些数据可以推测,突变表型将疾病的保护更少数量的功能性口袋与野生型相比。因此人们窝藏突变表型可能更容易受到疾病。突变体和野生TLR4蛋白质结构的变化如图3,4。

TLR9识别蛋白质结构突变的影响

突变rs5743836在上游地区即在t - 1237 c的基因和它不开放阅读框的基因。因此,这不是TLR9识别蛋白质编码的基因的一部分,不影响蛋白质结构。

基因分型分析

下的snp基因分型分析研究表明,TLR 2和TRR9基因是单型的印度人口控制和患者群体。TLR4 SNP的出现频率也低。没有纯合突变体在两个学习小组。AG(杂合的突变等位基因)的频率几乎是相等的,16%患者,对照组为15%。这表明这些突变在印度人并不普遍。

TLR4 SNP Asp29Gly,在白人人口的研究进行了研究。相关的研究表明,它是先天免疫相关疾病,如慢性炎性疾病和动脉粥样硬化(39岁,41)。另一组研究人员发现,在高加索人群TLR4 Asp299Gly多态性与减少血管造影冠状动脉疾病、血管炎症、和临床糖尿病[42]。

与此相反,鉴于SNP是很少报道亚洲民族。491年TLR4 Asp299Gly SNP研究汉族科目但作者未能发现任何纯合基因型[43]或杂合的变体。缺血性中风患者在华人协会TLR4基因多态性研究,几乎没有发现[44]Asp299Gly变体。在目前的研究还没有协会之间的多态性和血栓形成在印度人口。

tlr9识别- 1237 t / C变体研究人口在韩国和日本。韩国人口的低频率(< 0.3%)的变体是观察[45],而日本人口没有tlr9识别- 1237 t / C多态性是出现在183年系统性红斑狼疮患者和198名对照[46]。还报道说,中国人口也少得多的变化位置- 1237,我们的结果是根据这些研究,我们没有发现任何SNP在给定的位置在印度人口[47]。

3个snp等位基因频率的细节给出了图5中(表6)。

一个蛋白质的功能是极大地影响其结构。任何结构的变化可能会影响给定的蛋白质的功能。因此,蛋白质结构的变化由于存在相应基因的SNP可能改变它的功能。遵循这一假设我们想看到TLR2和TLR4基因的单核苷酸多态性的影响蛋白质结构。TLR2和TLR4突变蛋白港少口袋比野生的数量。蛀牙和空洞的重要配体在蛋白质绑定函数。许多小配体包括治疗分子结合在这些蛀牙。因此,增加或蛀牙导致蛀牙的表面积相应增加导致增强配体结合,反之亦然。,减少数量的绑定口袋将导致减少下游信号少,因此加重反应。结果表明,这些突变可以保护他们减少数量的绑定的口袋。 Thus, based upon above data we designed further studies on genotypic level by using PCR RFLP approach.

基因分型的研究表明,没有统计上的显著差异之间的控制和患者组织TLR4基因的多态性。这表明这些突变的发生频率非常低的印度人。同时,研究下的人口规模小是由于HA-VTE病人样本的可用性。因此,由于缺乏样本,无法建立可协会TLR多态性与疾病之间在目前研究。但在网上结果表明单核苷酸多态性被保护和与减少对疾病的易感性有关。因此,可以推测,突变表型人口如果存在可能导致更少的静脉血栓栓塞的易感性。这使得大范围的研究需要进行基因水平更大的人口规模。

作者非常感谢所有的志愿者参与了这项研究。我们感谢总局军队医学科学和科学家,员工,研究学者的研究所合作和提供后勤支持管理和健康和病人血液样本的集合。我们也感谢Zahid Ashraf博士JMI德里,印度在研究过程中对他的支持。