在临床和细胞免疫学的见解

ISSN:2640 - 2793

研究文章

关节炎小鼠骨髓细胞的分化与降低补充活动

彼佳Ganova和尼娜Ivanovska *

研究所的微生物学,免疫学,保加利亚科学院1113索非亚,保加利亚

*通信地址:尼娜Ivanovska,免疫学,微生物学研究所保加利亚科学院1113索非亚,保加利亚,电话:359 (+ 2)979 3195;电子邮件:nina@microbio.bas.bg;nivanovska@abv.bg

日期:提交:2018年12月24日;批准:2018年12月28日;发表:2018年12月31日

本文引用:Ganova P, Ivanovska n .关节炎小鼠骨髓细胞的分化与降低补充活动。观察细胞Immunol。2018;2:028 - 038。DOI:10.29328 / journal.icci.1001006

版权许可:©2018 Ganova P,等。这是一个开放的文章在知识共享归属许可金博宝app体育下发布的,它允许无限制的使用,分布,在任何介质,和繁殖提供了最初的工作是正确引用。

关键词:Zymosan-induced关节炎;树突状细胞;Mesnchymal细胞;成纤维细胞;巨核细胞

补充的先天免疫系统的重要组成部分的微生物检测和消除。补体激活有助于抵抗感染或降低死亡或受损的细胞在网站的伤害和病原体的入侵。相比之下,在慢性炎性疾病如自身免疫性疾病、过度或持久化补体的激活可以帮助破坏性的过程[2,3]。补充参与了RA的急性和慢性的发展阶段。C3c和C9组件和高浓度的mRNA C3,因子B, C3aR,和发现C5aR滑膜细胞间基质,同时与CD59的表达减少,膜攻击复杂(MAC)形成的抑制剂(4、5)。补充系统中扮演一个重要的角色在免疫系统和骨骼发育和体内平衡,特别是影响成骨细胞和破骨细胞(OC)活动[6]。通过增强osteoclastogenesis补体的激活可能会增加骨吸收,而招聘的成骨细胞前体可能支持骨形成。Anti-C3抗体抑制osteoclastogenesis添加时早期文化、抑制前体细胞的增殖和分化早期[7]。

间充质干细胞能够自我复制和分化为间充质组织的再生,如骨和软骨[8]。msc是有前途的候选人为各种组织工程应用来治疗轻度和中度OA[9],优越的结果取得了更大数量的msc注射[10]。他们表达的细胞表面标记,包括CD105 (endoglin)这是一个膜糖蛋白和转化生长因子受体的一部分复杂的[11]。其表情BM干细胞保证优越的软骨细胞的增殖和分化。树突状细胞(DC)能够触发MHC-restricted淋巴器官的自身免疫反应和炎症反应DC成熟和激活可能启动t细胞细胞因子的生产和b细胞抗体合成(12、13)。血浆DCs招募正常淋巴器官以及炎症网站,包括RA滑膜组织,他们接受当地的分化。骨髓直流前体填充正常休息滑膜组织中另外增强应对炎症趋化因子。Dendritic-cell-associated c -型lectin-1 (Dectin-1)是一个β-glucan受体属于Dectin-1家庭表达单核细胞,巨噬细胞、中性粒细胞和弱T细胞和B细胞。酵母聚糖、葡聚糖和mannan-rich配体激活Dectin-1-SYK Dectin-1配体之一,Toll样受体(TLR) 2-MyD88信号通路[14]。Dectin-1诱发DC成熟和细胞因子的生产,如独立IL-23 tlr [15]。 Dectin-1 and MyD88-coupled TLRs result in an enhanced production of IL-23, while the production of IL-12 is downregulated [16]. MKs develop from hematopoietic stem cells that reside mainly in the bone marrow. They account only for 0.01% of nucleated bone marrow cells [17]. MKs undergo a maturation process for five days in humans and for 2–3 days in rodents. They increase in size, become full of platelet-specific granules, increase their cytoplasmic content of cytoskeletal proteins. Binding of MKs to collagen I through α2β1-integrin inhibits proplatelet formation [18]. Platelets express a number of complement receptors, such as C1qR, C3aR, and C5aR as well as P selectin via which they bind plasma complement proteins, whereby they become activated. It should be noted that platelets contain a specific form of C3 [19] and also express complement regulatory molecules such as CD59, factor H, and decay acceleration factor, which prevent excessive complement activation on the platelet surface. Bone erosion is a result of the differentiation of mononuclear precursor cells to mature osteoclasts formed in the presence of macrophage-colony stimulating factor (M-CSF), and receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand (RANKL) within the synovial membrane [20]. In the bloodstream osteoclast precursors under the action of certain chemokines released at sites of resorption settle into bones and differentiate into OCs [21]. They attach to bone surfaces by integr在体外粘连蛋白受体αVβ3。当占领,αvβ3激活规范信号组成的复杂的c - src,麦克米兰,Dap12 Slp76,变风量空调3,Rac,允许细胞扩散,形成肌动蛋白戒指。没有任何组件的信号通路妥协破骨细胞骨吸收[22]细胞骨架组织和限制。

之前,使用补充消耗的模型,我们表明,缺乏功能补充活动强烈抑制滑膜炎的发展,通过减少C5a水平和滑液sRANKL [23]。同时,我们表明,功能补活动的消耗在关节炎急性期显著降低TGF-beta1/3的表达,BMP2 pSmad2,蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖的过度合成[24]。本研究的目的是探讨补充活动对BM的影响细胞分化在齐亚起始点。

动物

雄性和雌性Balb / c(8 - 10周大,体重20 g)是在动物饲养设施研究所的微生物学,保持在一个光身子h:黑暗周期和美联储标准饮食和自来水随意。在实验中使用完全60老鼠(每组由10老鼠)。所有的实验都是依照保加利亚机构指南№352 06.01.2012和动物保健委员会批准研究所的微生物学,索非亚。

Zymosan-Induced关节炎(ZIA)

酵母聚糖从酿酒酵母(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在蒸馏水re-suspended(40毫克/毫升),悬挂热压处理过的并存储在整除在-20°C。引起的关节炎是关节内的180年(一、)注入μg(10μl)短暂的麻醉下的酵母聚糖进入关节腔(戊巴比妥钠50毫克/公斤,i.p)。控制动物收到一封主义者注入同等体积的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)。炎症的初始峰值后第三天,第七天智障。组织学检查关节炎症为特征的单核细胞亚系层中的渗透,软骨损伤以及骨侵蚀[23]。

去补体小鼠腹腔注射1 ng / 20克体重眼镜蛇毒因子(CVF Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)72年和48小时前酵母聚糖诱导的关节炎。选择这个方案根据我们先前的调查CVF和不同浓度的不同重复测试[23]。我们达到了最低溶血性补充活动在这个方案不需要死亡率和5天恢复正常水平的替代途径(美联社)活动。

免疫组织化学

老鼠被杀死在第三天和膝盖被解剖,缓冲福尔马林固定2天的4%。组织固定在15% EDTA脱钙2周,脱水和嵌入在石蜡。矢状部分(5μm)的整个膝关节沾anti-mouse CD62P抗体(P-selectin,克隆RMP-1 Biolegend)。此外,幻灯片和PBS洗,阻止了1% BSA,清洗和HRP-streptavidin(1:10 0稀释;Sigma-Aldrich,德国)添加10分钟。幻灯片与民建联清洗和孵化解决方案工具包(3 ',3 'diaminobenzididne工具包,Abcam) 10分钟和吉尔的苏木精复染色3分钟。

BM细胞分化

股骨和胫骨提取成年老鼠的后腿,使用27 G针/ 1毫升注射器充满α-minimal必不可少的媒介(α-MEM,西格玛奥德里奇,德国)。悬架是轻轻吸气扰乱细胞聚集和在1800 x g离心5分钟。分析了细胞的一部分的表达CD29, CD105, CD14、CD86, CD265和CD369标记。

的第二部分BM前体(2 x106 /毫升)被种植在α-MEM补充10% FCS (Sigma-Aldrich、德国),5毫米谷氨酰胺,2.5毫米玫瑰,抗生素(链霉素2 U /毫升,青霉素G 100μg /毫升,amphotericine B 1μg /毫升(Sigma-Aldrich、德国)1天。Non-adherent细胞分离和贴壁细胞培养在补充α-MEM 10天的局部变化中每3天。在培养细胞收集和分析表达CD29和CD105标记。Non-adherent细胞resuspended,镀成24-well文化板块2 x106 /毫升细胞/毫升和刺激与重组小鼠集落刺激因子(gm - csf)(美国Biolegend) 10 ng / ml重组il - 4 + 0.3 ng / ml (Biolegend)的表达和分析CD14和CD86标记。

流式细胞术

细胞群体孤立如上所述与FITC染色anti-mouse CD29 (mesenhymal细胞,克隆恩(美国Biolegend 1 - 1), PE anti-mouse CD105(美国Biolegend成纤维细胞,克隆MJ7/18), FITC anti-mouse CD14(未成熟dc,克隆5 2 - 8,eBioscience), PE anti-mouse CD86(成熟的dc,克隆B7-2 eBioscience), PE anti-mouse CD265(等级、克隆R12-31、在体外创),PE anti-mouse CD62P(美国Biolegend P-selectin、巨核细胞克隆RPM-1), APC anti-mouse CD369(美国Biolegend Dectin1,克隆7 h1)。非特异性荧光被孵化与评估isotype-matched共轭马伯无关。流仪分析BD FACSDiva v6.1.2软件(美国新泽西州正欲)如下。门是在人口生活孤立感兴趣的事件进行分析。数据事件在这个门被显示在后续情节的百分比来确定不同的亚种。直方图允许查看单个参数对事件的数量。上面标志被指定积极事件。一个点的情节提供了两个参数显示的数据。同形像控制被用来确定象限标记将被放置的地方。象限标记两个参数块分为四部分来区分种群被认为是负面的,单一的正面,或积极的两倍。 The upper-left quadrant contained events that were positive for the y-axis parameter (PE) but negative for the x-axis (FITC) parameter. The lower-right quadrant contained events that were positive for the x-axis parameter (FITC) but negative for the y-axis (PE) parameter. The upper-right quadrant contained events that were positive for both parameters (double positive FITC+/PE+). The lower-left quadrant dysplayed events that were negative for both parameters.

统计数据

统计分析了使用InStat3.0和GraphicPad Prism 5.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。数据提出了意味着±SEM和比较不同组之间使用单向方差分析(一维方差分析)。P < 0.05的值被认为是具有统计学意义。

在目前实验BM细胞获得的第三天齐亚CVF老鼠从治疗或治疗进行流式细胞仪分析。我们调查的影响,补充消耗纤维母细胞和间充质细胞分化。CD29标志,特征为纤维母细胞中检测出高学位non-arthritic集团相比,关节炎的老鼠。CVF-pretreatment导致这些细胞百分比升高,关节炎,但相比显著降低,而non-arthritic(图1 a, C)。间充质CD105阳性细胞non-arthritic老鼠了大约15%,而在关节炎和CVF-pretreated组阳性细胞的百分比呈现~ 5% ~ 10%,分别为(图1 b, D)。接下来,从同一组细胞培养与补充的部分改变媒体了10天。流式细胞仪分析显示CD29 +纤维母细胞的分化抑制关节炎的老鼠,不施加CVF-pretreated组(图2 a, C)。间充质细胞分化也减少关节炎和CVF-treated组(图2 b, D)。

骨髓dc的分化在活的有机体内和在体外。数据显示的百分比不成熟的树突细胞CD14 +在non-arthritic升高小鼠相比,关节炎和CVF-treated老鼠。这个表达的抑制更CVF-group vs齐亚组(图3 a, B)。然而成熟CD86 +细胞在低百分比减少齐亚组(图3 a, C)。双阳性的比例CD14 + / CD86 +高non-arthritic组相比,齐亚和CVF-treated组(图3 a, D)。进一步,我们调查的影响CVF-treatment BM的gm - csf + il - 4诱导DC分化细胞在体外。结果表明,dc的成熟是抑制关节炎组的老鼠从CD14 +细胞百分比的增加明显,而non-arthritic组(图4 a, B)。相比之下,成熟CD86 +细胞的比例非常低,关节炎组,non-arthritic一旦相比,虽然CVF-treated组中间位置。成熟细胞的池是高于齐亚老鼠但低,相比non-arthritic老鼠(图4 a, C)。低比例的双阳性细胞CD14 + / CD86 +被发现在non-arthritic集团齐亚组显著增加(图4 a, D)。

在目前的研究中我们寻找存在的等级(CD265)阳性细胞在BM。结果表明,在关节炎小鼠等级+细胞的比例高于non-arthritic老鼠,而CVF政府废除了这种效果(图5)。齐亚的发展引发了一场CD62P +细胞的增加增强CVF-pretreated组(图6 a、B)。我们也观察到non-arthritic老鼠Dectin1池+ (CD369)细胞。zymosan-injected关节炎小鼠CD369 +细胞的比例升高,相反的效果被发现在CVF-treated组(图6 a、C)。这个结果可能是由于快速消除酵母聚糖颗粒decomplemented老鼠。MKs表达Dectin1 (CD62P + / CD369 +)在非常低的non-arthritic组在双阳性细胞数量增加关节炎组。这种效应在CVF-treated弱表达小鼠(图6 a, D)。阐明功能互补的角色在巨核细胞分化我们确定免疫组织化学的存在CD62P +细胞BM齐亚的第三天。关节炎小鼠大量炎症细胞一起建立了巨大的小巨核细胞和组血小板CD62P +这个群体的特征而在CVF-treated老鼠只有罕见的单一巨细胞(图7)。

风湿性关节炎的病理生理学涉及许多不同的细胞类型,所有这些导致腐蚀的过程。滑膜成纤维细胞激活坚持大量的滑膜想了解在RA的关键球员之一。他们有助于通过附加到软骨疾病的进展,入侵,导致软骨和骨骼退化(25、26)。所有组件的类风湿性滑膜mRNA的替代途径(美联社),除了备解素被检测到。然而,培养滑膜巨噬细胞释放C3和备解素而呈synoviocytes分泌因子B (27、28)。据推测关节炎传播是介导部分激活滑膜成纤维细胞的迁移[29]。一种可能性是BM细胞被推到间质或成纤维细胞分化已经在BM支持我们的观察这两个人口减少齐亚老鼠刚孤立的BM悬挂。另一种可能性是最终分化发生在组织在适当的介质。这一假说进行了测试在体外。BMs和部分改变培养10天中为了防止细胞释放介质,我们发现齐亚老鼠与降低分化为间充质或fibolast-like细胞的能力。这种比较认为最有可能分化的骨髓和在当地组织同时出现。

DCs在几个方面可能会造成RA的发病机制。他们定居在滑膜组织和滑液,他们现在在本地抗原,导致疾病永存。DCs配合synoviocytes和巨噬细胞产生炎症介质驱动RA病理(30、31)。在正常情况下,迁移休息直流前体进入组织和二级淋巴器官发生永久没有炎症的事件。Preseent数据显示,齐亚和减少相关的发展不成熟和成熟的DCs在骨髓和更大的关注减少不成熟细胞中观察到CVF-treated组。因此少DCs将释放到循环和驻留在组织。在体外BM的培养细胞gm - csf和IL + 4的存在表明,细胞从关节炎小鼠更容易刺激因此成熟的百分比DCs non-arthritic相比是微不足道的。

成为激活T细胞需要很多receptor-ligand交互在RA,进行轻微的破坏作用。激活细胞产生IL-17独立和协同效应与其他促炎细胞因子在滑膜进一步诱导细胞因子释放,基质金属蛋白酶生产,osteoclastogenesis。RANKL osteoclastogenesis和骨质流失的关键调节器,其独特的受体结合激活的NF-κB(排名)(32、33)。IL-17上调CD265(等级配体)表达对软骨细胞和成骨细胞,作用于软骨细胞新陈代谢降低蛋白合成,提高软骨退化[34]。我们先前的调查表明,BM细胞获得齐亚CVF显示抑制小鼠注射OC - csf +引起的地层RANKL [24]。在这项研究中我们调查在活的有机体内低补体活性的影响在BM破骨细胞生成。CD265阳性细胞在关节炎发展的早期阶段发现这些细胞的比例在很大程度上降低在decomplemented老鼠。因此,破坏性的联合流程可以通过调制成功有限的补充活动。

在补体激活C3组件被裂解成C3a和des-ArgC3a导致调制可由基质细胞衍生因子1 (SDF-1)和调节血小板在炎症[35]。MKs可能影响骨形成和骨重建引发成骨细胞增殖和/或抑制OC的发展。有这种可能性如果可行的MKs持续更长的时间在骨髓[36]。在体外,酵母聚糖用于先天免疫反应的研究,因为它会诱发炎症细胞因子的生产,可以激活补体缺乏免疫球蛋白[37]。酵母聚糖也能够提高DCs,增加成熟[38]- 2的生产。鉴于这些事实,我们检查了可能性酵母聚糖注入和持久性引发MKs和细胞检测酵母聚糖的表象。细胞表达CD62P在关节炎的老鼠被发现在decomplemented高架老鼠。这个标志表示在血小板我们无法确定巨核细胞的百分比。以及它的作用值得进一步调查补充活动megakaryocyte-dependant过程在关节炎症。建立了Dectin1阳性细胞和酵母聚糖老鼠身体,合理增加关节炎的老鼠。同时,Dectin1积极巨核细胞观察在齐亚老鼠CVF-treatment阻止这些pathology-related细胞的出现。此外,MKs的存在在炎症的网站是证实了免疫组织化学。慢性炎症在腐蚀性条件下如类风湿性关节炎会导致骨细胞的分化和prolifеration特异表达,滑膜炎症和骨髓,软骨和骨骼的退化。 CVF injection provokes C3 and C5 depletion for 5 days so the present results at day 3 of arthritis corresponded to the situation when complement cascade was blocked. Low complement activity altered mesenchymal and fibroblast-like cells and the ratio immature/mature DCs (Figure 8). Future experiments will help elucidation the role of complement in megakaryocyte differentiation and the consequences of inhibited platelet generation. These results can be used for determining the role of complement system at different stages of rheumatoid arthritis and can support finding of new therapeutic approaches.

p . Ganova计划支持的年轻科学家和博士生的保加利亚科学院授予DFNP-17-40/26.07.2017。