运动医学与治疗》杂志上

ISSN:2573 - 1726

研究文章

Chondrogenic re-differentiation后软骨细胞单层培养的潜力:比较骨关节炎和年轻的成年患者

Oishi一辉^{1 *},Shusa Ohshika¹,中国云南Frukawa²,本片津田³山本,Yuji¹和Yasuyuki Ishibashi¹

¹部整形手术,不管大学医学院毕业,不管,日本
²不管大学药理学系研究生医学院,不管,日本
³康复医学,不管大学医学院毕业,不管,日本

*通信地址:Oishi一辉,医学博士,美国骨科手术,不管大学医学院毕业,5 Zaifu-Cho,不管,青森县036 - 8562年,日本,电话:+ 81-172-39-5083;传真:+ 81-172-36-3826;电子邮件:kazuki.oishi04@gmail.com

日期:提交:2019年2月06;批准:2019年3月26日;发表:2019年3月27日

本文引用:Oishi K, Ohshika年代,Frukawa KI,津田E,山本Y, et al . Chondrogenic re-differentiation后软骨细胞单层培养的潜力:比较骨关节炎和年轻的成年患者。J运动医学。2019;4:016 - 023。DOI:10.29328 / journal.jsmt.1001038

版权:Oishi©2019 K,等。这是一个开放的文章在知识共享归属许可下金博宝app体育发布的,它允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。

自体软骨细胞移植(ACI)是一种接受治疗分离性肱骨小头骨软骨炎等焦软骨缺陷(OCD)和创伤性关节软骨损伤[1,2]。年轻和活跃的病人通常适合使用ACI [3]。由于单层培养的软骨细胞是经济和技术简单,它是最常见的方法在ACI细胞传播。然而,单层的软骨细胞导致戏剧性的变化在细胞形状和软骨细胞表型的损失,即减少II型胶原蛋白和aggrecan [4]。这些“去分化细胞”将恢复chondrogenic属性,如“re-differentiation”ACI治疗。最近,据报道,细胞表面标记(CD90、CD105和存在)的间充质干细胞(msc)表达在人体关节软骨细胞单层培养[5]。此外,众所周知,人类关节软骨细胞的细胞表面标记表达变化在单层扩张(5、6)。此外细胞MSC特色增加人类骨关节炎(OA)软骨[7]。

膝OA是膝关节的慢性退行性疾病伴随老化,这是一个主要公共卫生问题在老年人社会[8]。强迫症在OA和创伤性软骨的损伤逐渐进展。然而,使用与OA软骨细胞为ACI患者没有推荐,因为从OA患者自体软骨细胞的能力不是很好的记录re-differentiation (9、10)。已经有一些研究,比较了软骨细胞来源于OA患者和年轻的成年患者协会之间的通道,chondrogenic分化和细胞表面标记在单层培养(11、12)。本研究的目的是比较chondrogenic re-differentiation之间潜在的单层培养后老OA患者和年轻的成年病人。我们假设的软骨细胞老年病人减少了chondrogenic潜力。

样品

这项研究是医学伦理委员会批准的不管,大学医学院毕业。所有患者给予书面知情同意参加。5膝OA患者(5女性,平均年龄为69.6±8.4)和5复发肩膀脱位年轻患者没有OA(5男性,平均年龄为19.0±3.1)被纳入本研究。排除标准为我们的类风湿性关节炎的研究历史,肝脏疾病、肾脏疾病,恶性疾病。软骨组织从一个未受影响的部分股骨髁部和胫骨高原OA患者全膝关节置换术中,从肩胛骨的关节窝的边缘在关节镜板卡特修复手术复发患者肩膀脱臼。软骨细胞来源于OA患者定义为OAC,和软骨细胞来源于年轻成年病人定义为non-OAC。

细胞隔离其次是单层培养和球团文化

软骨细胞主要是培养和通道之前报道[13]。短暂,软骨碎片收集与胶原酶消化,和解放细胞悬浮在与20%胎牛血清的DMEM补充。坚持细胞被用作软骨细胞的主要文化,扩大了重复的段落。在通道1和3 (P1和3)。

4×105个细胞通道4 g离心10分钟450×15毫升聚丙烯管。丸是治疗chondrogenic感应介质为21天。Chondrogenic感应介质包括完整的培养基补充10 ng / ml转化生长因子(TGF) -β3(研发系统,明尼阿波利斯,美国)和100 nm地塞米松。

在单层培养细胞表面标记

流仪分析细胞表面抗原,软骨细胞是沾染了CD73-PE, CD90-APC, CD105-PerCP, CD44-BV421 (BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。细胞的通道1到3直到融合生长,使胰蛋白酶化和resuspended 50μl PBS含有2%的边后卫和一直在冰上,直到进一步的处理。细胞(5×105)悬浮在50μl PBS包含特定的抗体和孵化45分钟在冰上。PBS的细胞被洗,使用35-μm过滤器过滤(美国纽约康宁)resuspended 1毫升的使用FACSAria PBS和分析^TM2仪器(BD Bioscinences)。使用BD FACSDiva数据进行了分析^TM软件v 6.1.3 (BD生物科学)。

Chondrogenic相关基因表达在单层培养和颗粒的文化

chondrogenic-related基因的mRNA水平使用实时PCR分析。从在单层培养的软骨细胞总RNA提取(通道1到3)和颗粒文化使用NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel,杜塞尔多夫,德国)根据制造商的指示。每1μg总RNA进行反向转录作梦TraAce qPCR大师混合(试剂盒)。加热的反应是在50°C一分钟和95°C十分钟紧随其后40 95°C的周期为一分钟15秒和60°C使用ABI棱镜^®7000序列检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。特定的引物对每个基因(表1)被设计使用底漆表达软件(应用生物系统公司)。每个基因的表达水平是规范化的管家基因,glyceradeyde-3-phosphate脱氢酶(G3PDH)。

球文化的组织学评价

丸在10%甲醛固定,脱水通过串行乙醇稀释和嵌入石蜡。块切成5-µm部分和沾染了红色染料O,胶原蛋白I型(abcam、剑桥。美国)和胶原蛋白II型(Daiichi精细化工有限公司、富山、日本)。软骨形成进一步分析使用伯尔尼得分(总分,0 - 9)[14]。

统计分析

数据输入和计算进行SPSS版本。22.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。所有定量值表示为平均值±标准偏差(SD)。细胞表面标记物的表达比较OAC和non-OAC之间使用Mann-Whitney紫外线测试。基因表达水平的mRNA在段落通过方差分析比较图基事后测试。他们也比较OAC和non-OAC之间使用Mann-Whitney紫外线测试。伯尔尼分数OA组和对照组之间比较使用Mann-Whitney紫外线测试。P < 0.05被认为是静态意义重大。

在单层培养细胞表面标记

CD73, CD90和CD44显示值接近100%在每个通道没有显著差异在OAC和non-OAC(图1)。105年CD表达调节从通道1通道3两组。虽然显著低于OAC通道1,CD105表达增加同级的non-OAC通道2和3。

Chondrogenic相关基因表达单层和颗粒的文化

non-OAC,尽管COL2A1的表达显著减少到0.08倍从通道1到2和0.001倍从通道1通道3,在单层培养没有显著差异(图2)。COL2A1的表达、COL10A1 SOX9, AGCN显然从通道1粒文化增加了38,229 - 28 -,分别为18倍。

OAC, COL2A1的表达从通道1通道2,降低0.17倍和0.03倍从通道1段3(图2 b)。尽管COL1A1倾向于增加的表达,在单层培养没有明显差异。颗粒的表达SOX9文化相比显著增加了2.49倍的通道1。相比之下,COL2A1减少到0.18倍的表达从通道1粒文化。

比较OAC和non-OAC在同一通道或颗粒,OAC期间chondrogenic相关基因的表达高于non-OAC单层培养(图3)。尽管COL2A1通道1的表达,2和3是509年,787年和6466年分别乘以,颗粒减少1.61倍的文化。COL10A1 SOX9, AGCN也显示类似的变化,这是不到COL2A1。

球文化的组织学评价

球来自通道4细胞显示附近的等效均匀性和强度的胶原蛋白I型染色OAC和non-OAC(图3)。胶原蛋白II型强的强度比non-OAC OAC。没有统计上显著的差异在分量表和伯尔尼的总分得分OAC和non-OAC之间(表2)。

目前的研究调查re-differentiation OA患者软骨细胞的潜力和年轻的成年患者。细胞表面标记和chondrogenic OAC和non-OAC去分化相关基因表达变化在单层培养。虽然经济复苏chondrogenic除了COL1A1基因是劣质OAC non-OAC, chondrogenic相关基因表达和伯尔尼OAC的分数显示类似的结果,non-OAC单层培养后颗粒文化。先前的研究显示不同的结果对软骨细胞的chondrogenic潜力来自OA患者(9、10)。Dehne等。[10]报道,chondrogenic能力没有明显影响OA和矩阵ACI OAC满足要求。另一方面,杨et al。[9],报告说,从健康和OA关节软骨细胞之间的明显差异存在,这些都不是完全废除de - re-differentiation过程中。自从对照组不同,先前的研究显示不同的结果。

四个MSC标记,CD73, CD90、CD105和CD44, OAC和non-OAC中的。CD105和CD44视为标记指示分化(15、16)。CD105,也称为endoglin细胞surface-expressed受体,是转化生长因子β的一部分(TGF-β)受体复杂[15]。CD105的表达与分化,更增生性祖细胞状态。新孤立的关节软骨细胞几乎不表达任何CD105, CD105的表达逐渐增加与子栽培[5,17]。另一方面,细胞CD44是surface-expressed跨膜糖蛋白,作为受体结合细胞外基质化合物如透明质酸、骨桥蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白,和P - L-selectins [16]。CD44是参与招聘的间充质干细胞和再生的发病过程,因此可能是一个常见的间充质干细胞特性。因此,高CD105和CD44表达水平表明主要去分化细胞状态。在我们的研究中,CD44的表达已经高通道1,CD 105逐渐增加在单层培养和CD105的表达在OAC高于non-OAC通道1。这些结果表明,de-differentiation发生在单层培养,和OAC chondrogenic分化高于non-OAC。 This was further supported by the chondrogenic gene expression, which was higher in the OAC.

De-differentiation也观察到在OAC和non-OAC实时PCR分析在通道1和通道2(图2)。这是按照之前的数据显示,在单层培养软骨细胞减少大量COL2A1和越来越多的COL1A1during通道(18、19)。虽然non-OAC chondrogenic相关基因表达在单层培养很低,这是在同一水平上与颗粒的OAC文化(图3)。这些结果表明,non-OAC re-differentiation潜力。

有几个在这坚固的局限性。首先,从不同的关节软骨细胞是孤立的,它可能会影响chondrogenic基因表达和re-differentiation潜力。Novakofski等。[19]报道,不同的关节有不同的基线特征和应对伤害。因为道德原因,控制样品不能收获健康的膝关节。在这项研究中,收获了常规板卡特修复软骨的组织。第二,本研究没有探讨炎症环境中收获关节,这可能影响re-differentiation潜力。细胞因子,il - 1和TNF-α等诱导软骨退化和减少胶原蛋白II型表达式[21]。虽然炎症环境中,il - 1、TNF -α,没有评估,这是近似的血液检查和手术结果在本系列。第三,只有少数患者纳入本研究。巴贝罗等。[22],许多病人的chondrogenic能力调查,显示软骨细胞的大变化。 Although we investigated a small number patient, chondrocytes derived from young and old patient were used for this study. Finally, the availability of OAC was not confirmed in this study. Laganà M et al., reported that cellular yield and proliferation rates of OAC between the level of cartilage degeneration (ICRS score). Low degree of cartilage degeneration the cellular yield was maintained. However, Dozin et al., reported that cell proliferation significantly decreased with increasing age at Passage 1. In practical use, the effects of degeneration cartilage and age need to be carefully considered.

总之,本研究显示,re-differentiation OAC和non-OAC的潜力。更改细胞表面标记和chondrogenic OAC相关基因的相似non-OAC通过单层培养和颗粒的文化。虽然COL2A1表达恢复部分在OAC颗粒文化,chondrogenic相关基因的表达OAC non-OAC一样的水平。因此,从健康的软骨细胞部分膝OA患者可以用作ACI的细胞来源。

这项研究支持的部分项目专注于发展关键评价技术:评估再生医学领域的产业化从日本医学研究和发展机构艾湄湾和经济,贸易和工业,日本经济产业省。本研究也部分由奥林巴斯RMS有限公司。