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提交：2019年10月29日|得到正式认可的：2019年11月7日|发布：2019年11月8日

如何引用本文：Jain RK，Vakil D，Cunningham C，Sidhu K.人间充质干细胞调节培养基可促进伤口愈合过程 -体外学习。J干细胞的移植。2019;3：028-030。

doi：10.29328/journal.jsctt.1001016

版权许可证：©2019 Jain RK等。这是根据Creativ金博宝app体育e Commons归因许可分发行的开放访问文章，该文章允许在任何媒介中不受限制地使用，分发和复制，前提是适当地引用了原始作品。

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人间充质干细胞调节培养基可促进伤口愈合过程 -体外学习

Rashi K Jain1*，Devashree Vakil1，科里·坎宁安1和kuldip sidhu1,2

1CK Cell Technologies，Pty Ltd，澳大利亚
2澳大利亚新南威尔士大学医学院健康脑老化中心（CHEBA）

*通讯地址：Rashi Khanna Jain，CK Cell Technologies Pty Ltd，20/9 Hudson Avenue，Castle Hill NSW 2154，澳大利亚，电话：0416486066；电子邮件：rashi@ckcelltechnologies.com

抽象的
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间充质干细胞（MSC）条件培养基（CM）具有有希望的皮肤再生前景。因此，在制作CM之前，将人类牙髓和脂肪干细胞（DPSC和ADSC）分离，繁殖并评估其干性和遗传稳定性。我们的目的是在5 mg，10 mg和20 mg的伤口愈合过程中表征冻干ADSC和DPSC的适用性。通过直接人类皮肤成纤维细胞刮擦测定法评估伤口闭合的能力，并用AD-CM和DP-CM处理可变体外。此外，我们还评估了通过细胞因子阵列分析与伤口愈合相关的CM中ADSC和DPSC分泌的不同细胞因子和生长因子的表达。与对照组相比，我们的数据在24小时内在24小时内显示了AD-CM和DP-CM在伤口愈合中的显着影响。

介绍
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皮肤伤口愈合是一个有组织的过程，涉及用于修复和再生的专用细胞的远距离相互作用[1]。源自牙髓组织和脂肪组织的间充质干细胞（MSC）已广泛研究其干性，再生潜力和各种医疗条件的治疗[2-4]。最近，据报道，MSC衍生的条件培养基（MSC-CM）是重要生长因子和细胞因子有效的伤口愈合和修复的丰富来源[5-7]。随着这种方法的出现，可以评估从MSC-CM获得的冻干生长因子和细胞因子的安全性，剂量和保质期，从而使它们更接近于无翻译的细胞治疗疗法。

多项研究已广泛使用体外用于量化皮肤成纤维细胞迁移速率以进行伤口修复的刮擦测定，因为它提供了简单且经济的方案[8]。此外，在条件培养基（CM）中测试基本生长因子或细胞因子表达的最常用方法是通过细胞因子阵列分析[9]。在这种简短的交流中，我们评估了在不同浓度（例如5 mg，10 mg和20 mg）中使用冻干的DP-CM或AD-CM作为一种有希望的替代性非细胞伤口修复方法。此外，我们强调了CM中与伤口愈合基本存在有关迁移，增殖和血管生成所涉及的细胞因子。

材料和方法
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研究设计和患者样品

在牙医的知情同意书中提取了从健康个体中的第三摩尔牙齿，并以10 mL无菌磷酸盐缓冲液溶液转移到实验室。通过外科医生的知情同意，通过吸脂技术提取人脂肪组织，并转移到实验室内处理一个小时。根据我们的专利技术（PCT/AU2019/051029），牙齿浆干细胞（DPSC）和脂肪干细胞（ADSC）均为调节培养基（CM）。

条件媒体

从Xenofree/Serumfree（XF/SF）培养基（Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach，德国）和5％CO中培养了从P-3到P-5的DPSC和ADSC在T75组织培养烧瓶中培养2用于收获条件培养基（CM）。将培养物以75％-80％（3-5天）作为开始调节过程的标准。吸气了含有补充剂的培养基（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国），T75烧瓶用5 ml预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Miltenyi Biotec（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec，bergisch Gladbach，德国）冲洗两次。此后，将15毫升新鲜的GMP Xeno级无血清，无血清，苯酚红色免费和无补充培养基（Miltenyi Biotec，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）添加到T75烧瓶中，并在37°C下孵育24小时在5％的CO2。AD-CM和DP-CM通过0.45 µm滤波器，并在-80°C下存储在15 mL猎鹰管中。此后，将CM冻干并存储在 +4°C下。

刮擦伤口测定

在不同浓度（例如5 mg，10 mg和20 mg）下为AD-CM和DP-CM设置了实验。CHEBA专有的HDF06成纤维细胞系用于测定，在12孔培养板上将100,000个细胞镀在每孔上，在72小时后，使用无菌移液器的尖端创建了手动划痕。随后有两个PBS洗涤，在板的底部标记了特定区域，以在处理前拍摄照片。GMP级苯酚红色免费（PRF）培养基（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）被用作对照，在2 mL的PRF媒体中重新构成了5 mg，10 mg和20 mg lyo ad-cm和DP-CM在HDF06细胞中添加24小时。24小时后，观察到间隙闭合的划痕，并在同一标记的位置拍摄照片。使用Image J软件（https://imagej.nih.gov/ij/）分析了差距封闭。

细胞因子阵列分析

称重DP-CM和AD-CM的冻干粉末，并在1 mL反向渗透（RO）水中重构。按照制造商的说明（R＆D Systems，Inc。，美国明尼阿波利斯，美国）进行了细胞因子阵列分析。简而言之，在用阵列缓冲液6堵塞膜一小时后，将775 ul的DP-CM和AD-CM与725 UL阵列缓冲液6混合，并添加到膜上以在振荡器上的4OC孵育过夜。第二天，根据制造商的说明，将膜洗涤并用特定的缓冲液处理。通过使用化学发光（Fuji Las3000凝胶文档系统和LAS3000软件）暴露膜。使用图像J软件（https://imagej.nih.gov/ij/）使用阵列分析仪对膜进行分析。从样品值中减去阴性对照点的背景强度以获得归一化的光密度测定值。

统计分析

结果对结果进行了统计分析。数据将数据作为平均值±标准偏差（SD）表示，并在一式三份中进行了实验。所有统计分析均在显着性水平p <0.05下使用三向方差分析（ANOVA）进行多次比较。

结果与讨论
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已经对脂肪和牙髓组织衍生的干细胞的应用进行了广泛的研究，它们代表了无细胞或无细胞疗法的有希望的来源[3,4,10,11]。在这种交流中，我们简要强调了DP-CM和AD-CM作为无细胞修复和再生的一种潜力。我们的数据表明，AD-CM和DP-CM由几种基本生长因子和伤口修复的细胞因子组成。此外，我们可以在这里强调，在受控实验室治疗条件下，冻干CM的批量生产可能是可能的。

随着时间的流逝体外，我们的数据表明，冻干的AD-CM和DP-CM在10 mgs和20 mg浓度下均导致24小时时间点的间隙闭合（图1,2）。但是，SCRATCH分析在创建划痕的协议中有其自身的限制，该划痕启动了LAB间差异[8,12]。为了进一步证实我们的研究的相关性，我们分析了CM中伤口修复中涉及的基本生长因子的表达（图3）。


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图1：冻干的DP-CM和AD-CM在刮擦伤口中的剂量反应，代表了显着的差距闭合百分比闭合，这对应于人类皮肤成纤维细胞迁移的距离。


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图2：与0小时和24小时的对照相比，与5 mgs，10 mgs和20 mgs DP-CM处理的人真皮成纤维细胞的迁移相比，具有代表性的刮伤伤口测定图像。


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图3：细胞因子阵列分析显示，AD-CM和DP-CM分泌的细胞因子的归一化光密度学值对伤口愈合很重要。

据广泛报道，SERPIN E1，HGF和BFGF在再上皮化，肉芽组织形成并增加成纤维细胞增殖中起着重要作用[13]。MSC在血管生成中的作用引起了极大的兴趣，因为血管生长不足会导致伤口愈合障碍[9]。许多研究报道了血管生成蛋白，VEGF，EGF，HGF，TGF-α和IL-8或IL-6（表1）对内皮存活，迁移和增殖的重要性[12,14,15]。总的来说，这些基本生长因子足够表达，并表明DP-CM和AD-CM在伤口愈合中的潜在适用性。需要对动物模型以及临床试验进行进一步研究以证实数据。

表格1：与脂肪和牙齿间充质干细胞评估和分泌的重要细胞因子的功能有关的总数105的伤口愈合
CM中分泌的细胞因子 功能
血管生成蛋白 血管生成
表皮生长因子（EGF） 成纤维细胞的扩散
成纤维细胞生长因子碱基（BFGF） 成纤维细胞增殖和基质沉积
粒细胞巨噬细胞-Colony刺激因子（GM -CSF） 表皮细胞的增殖
肝细胞生长因子（HGF） 肉芽组织形成
白介素6（IL-6） 再上皮化
白介素8（IL-8） 再上皮化
巨噬细胞刺激因子（M-CSF） 干细胞祖细胞支持
血小板衍生的生长因子（PDGF-AA） 细胞迁移
转化生长因子-α（TGF-α） 早期再上皮化
血管内皮生长因子（VEGF）
Serpine1		 血管发生调节剂
细胞迁移
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人类成纤维细胞HDF06是在UNSW的知情同意书（HREC批准＃HC-15025）的情况下获得的，这是澳大利亚新南威尔士大学的健康脑老化中心。

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参考
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