柑橘静脉韧皮部变性(CVPD)是在印尼柑橘类植物的主要疾病。这种疾病是由革兰氏阴性细菌引起的,CandidatusLiberibacter asiaticus。几乎所有的柑橘类植物易受这种疾病和只有少数柑橘类植物如无籽石灰(柑橘aurantiifoliavar。Seedles)和kinkit柑橘类(Triphacia三叶的)是宽容的。这两种柑橘类植物存储CVPD的DNA片段^r这是宽容的因素(841个基点)。然而,这项研究发现CVPD^rDNA片段也发现在柑橘类植物容易CVPD疾病。本研究旨在研究从CVPD DNA多态性^rDNA片段在柑橘类植物在巴厘岛。PCR检测表明t . trifoliate和c . aurantifolia耐CVPD和Pylogenically在同一组c . nobilisvar Buleleng,c .网状var。猎人Buleleng,c . amblicarpa。另一方面,柑橘类植物容易CVPD是在一个不同的组。有两种类型的不包含CVPD柑橘类植物^rDNA片段,即c . nobilisvar。Petang和m .香这些结果表明,CVPD l^rDNA片段多态性是宽容CVPD疾病的一个因素。

柑橘是园艺植物是非常重要的在印尼人民的经济。这个工厂一直在印度尼西亚和培育[1]。柑橘是一种当地的水果,几乎市场上,柑橘类水果的质量会受到各种因素的影响,包括攻击的柑橘静脉韧皮部变性(CVPD)。所有种植柑橘类植物易受CVPD疾病袭击[2]。另一方面,据报道,几种类型的柑橘类植物,尤其是那些用更少的经济价值,是已知的耐CVPD。耐CVPD类型的柑橘,以下简称CVPD柑橘^r基因。柑橘类植物抵抗CVPD (CVPD^r)被认为包含基因产生一个特征能够打破CVPD的致病性感染(l . asiaticum),或者是能够抵抗病原体的传播由向量昆虫[3]。

一个基因命名CVPD^r基因扮演了一个角色在柑橘CVPD阻力。的CVPD^r基因存在于柑橘类植物是耐药或相对耐CVPD疾病,即Kinkit柑橘和无籽柠檬柑橘。但CVPD^r基因在柑橘暹罗Kintamani还发现,这是一个容易感染疾病CVPD柑橘作物,所以很难解释CVPD疾病感染的机制。CVPD是可能的^r基因不表达所以不能发挥好作用提供抵抗CVPD疾病的能力。的CVPD^r基因功能移除障碍CVPD营养的吸收进入植物细胞的细菌。的CVPD^r基因位于染色体的柑橘类植物,但其分子水平的作用机制是未知的[3]。

本研究旨在确定致病性CVPD在各种类型的柑橘类植物在印度尼西亚巴厘岛。本研究使用的分析聚合酶链反应与O (PCR)₁₁和O₁₂引物,扩增DNA片段测序。DNA片段的序列从各种类型的柑橘类植物在巴厘岛将分析多态性可能与CVPD感染率有关。在所有的培养柑橘如橘子,柑橘,暹罗柑橘、柠檬柑橘、柠檬没有种子柑橘和其他柑橘类水果,是基因CVPD搜寻的存在^r使用引物的PCR和基因CVPD^r[4]。

类型的研究和样本来源

这项研究是一个实验研究生物技术实验室,Udayana大学印度尼西亚巴厘岛。测定样品在这项研究中使用的样本柑橘叶片抗和容易CVPD疾病从几种类型的柑橘类植物即kinkit (Triphacia三叶的)、无籽石灰(c . aurantiifoliavar。无核)、暹罗柑橘类(c . nobilis)、橘子(c .网状)和酸橙(c . amblycarpa)在柑橘种植园在巴厘岛的中心。

DNA PCR隔离和DNA分析

总使用NucleoSpin柑橘类植物的DNA被隔离^®植物从Marchery-Nagel II工具。样本取自叶骨骼通过观察症状CVPD攻击和检测使用PCR分析。检测基因CVPD的存在^r由PCR分析使用WR-F WR-R和使用程序变性94ºC的温度为60秒,退火的温度60°C 30秒,和伸长72ºC的温度为90秒。所有这些阶段进行了36个重复周期[3]。

琼脂糖凝胶电泳和PCR可视化

1%的琼脂糖凝胶由琼脂糖溶解在100毫升TAE缓冲区(包括40毫米三羟甲基氨基甲烷醋酸液pH值7.9;2毫米EDTA钠)。DNA样本(8 + 2µlµl DNA加载染料)凝胶中的每个都坑。电泳和执行为±20分钟100伏特的电压。浸泡在EtBr解±15分钟。然后电泳的结果被显示为一个紫外线透照器看到乐队的位置每个样本的DNA,然后记录。

CPVDr基因表达的DNA测序分析

测序分析现代自动化DNA测序机器可以一次384个荧光色样品在单个批处理(电泳),可以进行一天24次。这只包含分离的过程,阅读的过程曲线,测序反应,清洁和溶解在合适的缓冲溶液必须单独完成。获得标签反应能被探测到的结果从印刷DNA,“循环测序”的方法是最常用的。在这种方法中先后主要进行退火,扩展DNA聚合酶和变性(融化)股DNA印刷多次(批准轮)。周期序列的主要优势是它更有效率。每一步循环测序进行通过改变反应温度使用热循环PCR [5]。

从地形上,平均采样位置是在海拔800米的高度。从气候,仍然是一个热带气候通常由五个月的雨季和旱季的七个月,和空调非常新鲜、干净,因为污染因素仍相对较低。年平均降水量2000至2500毫米,而平均最低气温是24⁰C和最多32⁰C与气候、降雨和气温因素表明适度的条件,动植物生活很好。

检测CVPD^r片段聚合酶链反应对几种类型的柑橘类植物分布表明,敏感和耐药柑橘类植物之间的差异。脆弱的柑橘类植物包含CVPD显示积极的结果,但是也显示包含CVPD积极的结果^r,如表1中解释。

PCR分析结果显示,来自27个样本的柑橘类植物,多达25个样本包含CVPD的DNA片段^r(841个基点)。然而,只有2柑橘品种耐CVPD疾病,即t . trifoliate和c . aurantifoliavar。无核柑橘类。另一方面容易CVPD有柑橘类植物。研究还发现,两个样品来自27个柑橘类植物没有包含CVPD的DNA片段^r,即c . nobilisvar。Petang和m .香l . PCR分析结果呈现在图1、2。

研究基因的多态性CVPD^r在一些柑橘类植物用柑橘类植物的样本在巴厘岛,作为控制用柑橘类t . trifolia助教,和柠檬没有种子(c . aurantifoliavar。无核),这被称为一个柑橘类植物抵抗CVPD攻击。让CVPD^r基因多态性在几个柑橘类植物在巴厘岛测序完成使用引物PCR结果向前(1):GACTAGGTGGTAATAACTACTTTT和反向引物(1 r): CCTTTTTGGTCTATCTTTACTTAG和基础放大从PCR过程是841个基点。总DNA隔离使用nucleoSpin迷你设备工厂^®植物从Marchery-Nagel II。在PCR反应,使用1 ng DNA样本,引物100摩尔P011 P012c, 2μl核苷酸,2μl PCR缓冲(10倍),0.2 Taq (5 U /μl)。PCR程序使用预处理在92ºC 30秒用一个旋转,变性为60秒在92ºC,退火30秒60ºC, 72ºC伸长与40 90秒。在72ºC扩展90秒用一个旋转[3]。PCR产品在琼脂糖凝胶电泳检测TA 1% (w / v),然后squencing DNA片段CVPD^r。测序过程只使用引物向前(1):GACTAGGTGGTAATAACTACTTTT和引物及预后(1 r): CCTTTTTGGTCTATCTTTACTTA。PCR分析结果呈现在图3,4。

PCR分析DNA分离出几个抗性和敏感的柑橘类植物样本显示,来自27个柑橘类植物样本包含CVPD 25样品^r(抗性基因),这证明了他们的存在在841个基点。主要是底漆用于CVPD序列^r检测。在图3中暹罗Petang样本(c . nobilisvar。Petang)没有检测到4号线(四),这证明工厂的样品没有耐药基因,很可能使用的样本有严重CVPD疾病和不使用的主要耐药基因检测出来。

在另一个在图4中显示的PCR分析Kemuning (m . peniculata)第6行并不是所以CVPD没有检测到^r基因。这是因为m . peniculata跳蚤的寄主植物。CVPD传染病昆虫会更积极的在高温下(低地)相比,低温(高地)。从本研究的结果发现CVPD的存在^r基因在所有类型的柑橘脆弱和耐药如橘子、Siem柑橘、Selayar柑橘,巴厘岛的柑橘、Kingkit柑橘和无籽柠檬柑橘样品。

CVPD多态性的DNA片段^r基因

此外,25的27个柑橘类植物样本研究表明CVPD的示例包含DNA片段^r,容易CVPD疾病。这项研究的结果表明,CVPD^rDNA片段在这种柑橘类物种或品种并不奏效而可能导致突变或抵抗CVPD疾病所需的其他基因。因此,我们研究CVPD^rDNA片段多态性。CVPD DNA序列的DNA片段^r然后执行,结果如表2所示。

结果显示CVPD^r基因多态性之间的橘子柑橘、暹罗柑橘、Selayar柑橘、t . trifoliaSeedles柠檬柑橘,柑橘,容易CVPD。多态性的基因的出现,表明存在一些分歧在柑橘类植物的DNA序列的采样与不同或相似的物种。DNA序列的差异是由于发生删除,插入,重组,随机选择婚姻和低人口[6]。到目前为止,通过图书馆研究没有发现CVPD多态性的研究报告^r基因片段在柑橘类植物在印尼。在这项研究中CVPD^r基因显示目标积极发现乐队在25个样本来自27个样品就读于841个基点。电泳法是一个通用的方法,可以应用于展示大量的酶的多态性。通过这种方法,可以发现酶分子的结构变化导致分子电荷的变化[7]。

图5显示了几个种柑橘类植物在巴厘岛的发展史。系统发育树是一种逻辑的方法来显示进化生物之间的关系。系统发生学是一种模型来代表祖先的生物之间的关系,分子序列或两者兼而有之。系统编译的目标之一就是精确构建生物之间的关系和估计差异发生从一个祖先的后代。系统发生学分析了变化,可以发生在不同的生物体的进化。根据分析,序列亲密可以被占领旁边的树枝。

这项研究的结果表明,有许多DNA多态性CVPD样本中^rDNA片段。系统发育树来自示例多态性表明Kingkit柑橘类(t . trifoliatevar。无核)和柠檬柑橘类(c . aurantifolia)位于相同的集群,而其他样品在不同的集群。这些结果表明,在CVPD DNA多态性^rDNA片段导致柑橘类植物的抗性差异CVPD疾病。多态性的存在超过一个等位基因的基因位点的等位基因频率在人口很少超过百分之一。基因多态性发生由于基因的核苷酸组成的变化。基因成分的变化是受几个因素的影响如自然或人工选择、交配和突变。这些变化会影响生物体的表型变化[8]。

亲缘关系和进化生物之间的关系可以被描述在系统发育树。研究系统发育树的目的是重建系谱关系(家谱)和生物之间确定一个生物体的进化时间。系统树是一种图形组成的树枝或节点。两个相邻节点连接的一个分支。节点代表分类单位,而分支机构代表分类单元之间的关系。分支模式在系统发育树被称为拓扑。一个分支的长度代表了不同的分支。可以物种分类单位,数量,个人或基因[9]。

可以使用几种统计方法重建系统发育树。其中一个是常用的统计方法,即贝叶斯方法。贝叶斯方法是一个种系发生树重建方法,该方法使用最优标准(最优标准)。该方法具有相同的概念可能的方法,它使用概率分布的树木找到最合适的数据序列的系统发育树。每个序列的位置对齐序列称为字符,而核苷酸被称为“州”贝叶斯方法。所有的位置字符是分析了独立或相互分开,所以,每个对齐列认为是一个独立的进化过程的实现。贝叶斯方法让研究人员来确定自己的模型等模型参数替代,长树枝,和树拓扑[10],如图5所示。

有片段DNA多态性CVPD^r柑橘,脆弱和柑橘类植物抗性或宽容CVPD疾病。PCR检测表明t . trifolia助教和c . aurantifoliavar。无核耐CVPD, Pylogenically在同一组吗c . nobilisvar。Buleleng,c . nobilisvar Tabanan,c . nobilisvar Payangan,c . nobilisvar Pecatu,c .网状var。猎人Buleleng,c .网状var。Keprok Manggu,c .网状var。Keprok Besakih,c . amblycarpa。另一方面,柑橘类的植物敏感CVPD是在一个不同的组。有两种类型的不包含CVPD柑橘类植物^rDNA片段,即c . nobilisvar。Petang和m .香l . CVPD^rDNA片段表示一个重要的角色在柑橘类植物的抗性机理CVPD疾病。

本研究支持Udayana大学研究批准号:383 - 5 / UN14.4.A / LT / 2018

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