花青素含量测定的两个品种木槿Sabdariffa从雪兰莪州,马来西亚用色谱法和光谱法

木槿的花萼sabdariffa已经被许多社区使用草药茶。他们的花青素内容已报告反肥胖研究的重要组成部分。现在工作报告结果的花青素含量在两个品种的花萼h . sabdariffa来自Sabak Bernam,雪兰莪州,马来西亚。样品已经通过验证的植物标本,大学生物科学学院Putra马来西亚前研究。样本处理和地面干燥原料及其水提物进行了分析使用傅里叶变换红外(FTIR)和二维红外(2 dir)。混合花萼短(FT11-15A)原材料光谱显示,超过80%的相似性和长野生品种花萼(FT11-15B)当使用“比较”分析。两个样本的差异很明显他们的水提物光谱所示。峰值为1672厘米¹和841厘米¹表明tri-substituted双键在FT11-15B水提物并不是出现在FT11-15A水提物光谱,即双峰值被分配在1221厘米¹指反对称性拉伸的芳香和乙烯= C -O与其他= C - C -O,1192厘米¹分配平面δ碳氢键在FT11-15A水提物。峰值为1071厘米¹分配的平面弯曲键碳氢键的苯的样本是唯一峰值比得上标准花翠素和花青色素用于样品的确认和量化的内容。水提物的光谱样本显示更多的峰值检测与原材料光谱相比,这是归因于较高的花青素在水中的溶解度。2 dir关联能谱法有利于提高草药产品的定性分析。花青素含量两个品种h . sabdariffa按照金额delphinidin-3 -O-sambubioside (DS)、cyanidin-3 -O-sambubioside (CS), delphenidin-3 -O葡萄糖苷(DG)最后cyanidin-3 -O葡萄糖苷(CG)。FT11-15A有更多内容的DS和DG的原材料和水提取物的CG +比FT11-15B组织,即,FT11-15B CS的更多内容,CG的原材料和DS, DG, CS的水提取物比FT11-15A +组织。

花青素是生物黄酮素与许多健康益处防止无数的人类疾病的能力。因此,定量测定花青素h . sabdariffa植物是非常重要的在确保其最大疗效并确保产品声称含有花青素的质量对消费者的好处。

木槿sabdariffa,一位著名的草本植物在马来西亚[1],属于家庭锦葵科,在当地被称为“洛神葵”[2]。成功是一个重要的一年生作物生长在热带和亚热带气候[3]。其肉质花萼(萼片)周围的水果(胶囊)用于生产各种饮料和商业产品。治疗肥胖的使用h . sabdariffa深入研究[4]。事实上,许多重要的证据h . sabdariffa在降低沉积脂肪的脂肪组织[5],有动机的调查。奥赫达的研究等。[6],显示分离花青素delphinidin-3 -O-sambubioside和cyanidin-3 -O-sambubioside从h . sabdariffa通过生物测定引导净化显示IC50值分别为84.5和68.4 g / mL。获得的结果与相关的类黄酮苷[7]。动力决定表明这些化合物抑制酶活性,与底物竞争活跃网站[8]。

一般来说,许多植物代谢的内容受到气候变化等因素的影响,不同类型的土壤,矿物含量的水供应和肥料应用[9]。这些因素与植物的地理起源和发展条件,植物的年龄,收集时间、样品处理和植物[10]的品种。

杂交是不容易的h . sabdariffa因为它的cleistogamous繁殖[11]的性质。作为h . sabdariffa四倍体的物种,属于隔离人口,它需要时间来实现固定比二倍体物种。诱变育种计划是由我们引起新的遗传变异与马来西亚Kebangsaan大学合作(UKM)和马来西亚1999年原子能机构[12]。一些有前途的养殖生产。三个新品种UKM发起2009年4月。他们叫UKMR-1 UKMR-2和UKMR-3使用各种开发阿拉伯作为父品种诱变育种计划自2006年以来[13]。指的是农业国家农作物品种在马来西亚注册列表2010年,有四个品种h . sabdariffa注册即阿拉伯、UMKL-1 Sotong UKMR-1。

另一方面,两个自然的品种h . sabdariffa被发现在Sabak Bernam,雪兰莪州,马来西亚。很多最大的花萼长8厘米长显然是区分[14],从混合各种短花萼(4 - 5厘米)由农业部认可UMKL-1 [15]。花萼长品种或野生型比UMKL-1更大的规模和重。即使是红色的花萼比UMKL-1暗长。身体的两个品种h . sabdariffa是不同的,很难确定各类化学成分的复杂混合物。本研究关注的是花青素的内容这两个品种h . sabdariffa。这是很重要的,因为当用作草药茶,植物磨成粉末形式和存在于茶叶袋。因此,差异化的内容通过胶囊前景无法确定。

使用高效液相色谱法(HPLC)在自然产品[16]是一个受欢迎的分离技术由于其精度显示化合物在色谱峰。然而,样品制备可能是一个耗时的因素。应用光谱学技术纯化合物[17],是目前常用的,然而类似的技术,原材料需要专业知识和经验解释。决定使用这种技术是基于样本的破坏性更小的准备[18],这使得它方便和快速的方法应用[19]。提取过程应该几乎容易行为和获得的光谱是可重复的进行进一步分析。随后整个光谱[20],应该完全显示工厂的身份。然而,这种光谱技术没有区别h . sabdariffa和其潜在的直接提取到最大限度。因此,本研究的目的是比较和确定两个品种的花青素含量h . sabdariffa定性和定量从Sabak Bernam,雪兰莪州,马来西亚使用色谱和光谱方法。

材料

植物材料:两个品种H sabdariffa花萼获得从一个农场被国家农业部Sabak Bernam,雪兰莪州,马来西亚。混合品种较短花萼长贴上FT11-15A和野生品种FT11-15B花萼。两个凭证标本制备和储存在植物标本,生物科学部门,与凭证没有马来西亚Putra大学:2917/15。

花青素标准:四种类型的花青素标准从默克有限公司购买他们delphinidin-3 -O-sambubioside delphinidin-3 -O葡萄糖苷,cyanidin-3 -O-sambubioside和cyanidin-3 -O葡萄糖苷。

样品处理

输入一个指数花萼品种选择。每个工厂随机选择从种植园Sabak Bernam,雪兰莪州,马来西亚。每个单独的芙蓉的花萼单独摘和积累。5公斤的每个不同的h . sabdariffa本研究收集。删除种子后,花萼清洗和风干在室温下,直到干物质的80%。花萼被进一步干燥炉(Memmert™乌尔姆600)40 oc使用额外的3 - 4天简单的托盘储备汤样本破坏真菌或细菌。干花萼被地面使用搅拌机(Retsch™GM200德国造)。最好的样本筛选获得的150µm(标准试验筛,“CE”)。

谱仪和软件系统

光谱扫描是用傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪(频谱GX,优秀的公司,英国),配备了硫酸triglycine探测器。这个系统是10.5.0珀金埃尔默频谱模板与软件版本。软件系统安装2 dir (TD软件)对二维相关光谱和软件定量”进行数量分析。这台机器是位于一个单独的房间,房间相对湿度控制除湿机。

溴化钾为红外光谱扫描(KBr)盘:干花萼的比率与溴化钾粉末地面1:200最低相对湿度环境下。KBr和样本混合物按不超过10 psi成为薄盘下的中红外光谱扫描波数4000 - 400厘米¹4厘米¹决议。光谱选择传输实现超过60%时通过扣除最高传输到最低的传播。的频谱sp.保存在文件系统。

花青素的标准都使用类似的方法处理。后的光谱样本和标准进口相同的图比较。

2 dir扫描:第一次扫描后,阀瓣是放在样品室的热量提供2 dir相关光谱。得到了一系列的光谱在10摄氏度间隔30 - 120摄氏度的范围,分析了TD软件(升级版2015)由清华大学开发的。

样品的红外光谱分析序列的芙蓉和软件“量化”

首先原始干和粉花萼从两个植物品种用于红外光谱盘。光谱分析用软件“量化”。后的干和罚款花萼UMKL-1 (FT11-15A)从每个植物品种用于水提取。类似的步骤是重复的样本h . sabdariffa var sabdariffa(FT11-15B)。

h . sabdariffa热水提取样本

两个品种的干花萼H sabdariffa分别提取(50克)。样本与蒸馏水混合粉(250毫升)在80 oc,用了半个小时。每个品种的滤液后累计三次重复提取。后,滤液lyophilised使用冷冻干燥器中脱。收益率是贴上FT11-15A水提物和FT11-15B水提物。

软件“量化”进行数量分析

制定标准曲线:建立的标准曲线绘制不同浓度的选择样品标准从Kepala巴塔,马来西亚槟城,。5批h . sabdariffa相同的样本公司,积累了从不同的年。他们是英国《金融时报》的34/14干样品从该公司购买的2014年,英国《金融时报》的35/14样品收集来自同一公司下的农场和加工的植物化学实验室,IMR。英尺的10/15样品收集在2015年,来自同一个农场和2016年FT15/16, Herbagus干洛神葵粉的包装产品从同一家公司(表1)。所有的样品都在高效液相色谱(HPLC)分析不同浓度(1毫克/毫升,5毫克/毫升,10毫克/毫升,15毫克/毫升,20毫克/毫升,25毫克/毫升)。原材料和热水提取加1% Trifluroacedic酸(组织)样本用于分析。毫克/毫升的平均数量和标准导数计算为每个5批次的花青素h . sabdariffa样本。

毫克的等量样品用于高效液相色谱光谱被用来制造。当这一切都完成以后,高效液相色谱的结果与频谱配对。标准曲线是通过算法比尔定律与高度选择的高峰和两个基地山峰特别为每个花青素。光谱和高效液相色谱的结果是建立了相关的软件“量化”功能图标“审查”。

花青素含量预测的示例:样品英尺11-15A和FT11-15B Sabak Bernam磨成粉末形式处理和频谱。这些准备光谱导入到系统作为独立的验证和预测花青素的分析基于标准曲线(表2、3)。在实践中,样本的光谱需要使用类似材料用于标准曲线。花青素含量下的样本预测系统的预测误差。这些数据被转换为相应的比例。

表3:花青素的标准曲线类型水提取物+组织
下载图片	名字DS 类型的适合线性 峰高计算类型 峰1 X 1068.38 峰1基地1 X 1085.69 峰1基地2 X 978.79 0.990043相关 标准误差0.045454 (9月)0.0543994标准错误的预测
下载图片	名字DG 类型的适合线性 峰高计算类型 峰1 X 1631.12 峰1基地1 X 1695.30 峰1基地2 X 1562.53 0.996917相关 标准误差0.000201883 (9月)0.000290146标准错误的预测
下载图片	名CS 类型的适合线性 峰高计算类型 峰1 X 1062.31 峰1基地1 X 1085.66 峰1基地2 X 984.63 0.994022相关 标准误差0.0137572 (9月)0.0169519标准错误的预测
下载图片	名字CG 类型的适合线性 峰高计算类型 峰1 X 1062.69 峰1基地1 X 1085.66 峰1基地2 X 975.83 0.999883相关 标准误差4.41722 e - 005 (9月)0.000199391标准错误的预测

高效液相色谱方法

定性和定量决定洛神葵提取物的主要成分是水域2695联盟高效液相色谱系统上执行®(美国马水域®)配备996光电二极管阵列检测器和连接到一台计算机运行水域授权2®软件。C-18列(Phenomenex Luna 3 _m 100×4.6毫米,证件)由C-18保安把守墨盒(4×3.0毫米,身份证)保持在室温下使用。标准和样品分离的流动相的溶剂含有水:组织(20:0.001;v / v)和溶剂B: ACN:组织(20:0.001;v / v)。以下使用梯度洗脱:0 - 2分钟,30% B;2 - 10分钟,30 - 50% B;10 - 20分钟,50 - 95% B最后洗列95% B 2分钟整理列和30%的B权力平等主义的2分钟。流量为0.5毫升/分钟和注入体积的样品和标准是10µl。峰值检测到340海里。

5毫克的h . sabdariffa干水提物粉末加入1毫升MiliQ水在室温下,用30分钟。那么解决方案是过滤(0.45μm尼龙)进行高效液相色谱分析。

身份验证

植物样品标签FT11-15A像芙蓉sabdariffa var UMKL-1认证。植物样品标签FT11-15B被验证木槿sabdariffa var sabdariffa。

红外光谱的光谱h . sabdariffa

煎煮后的原料:这两个品种h . sabdariffa原材料煎煮后显示不同模式的光谱与光谱标准的花青素的基本模式(图1)h . sabdariffa煎煮后原材料光谱说明四个部分的波数范围。第一部分从3800 - 2500厘米¹通常被发现在大多数的天然产品O- h伸长振动组(3422厘米¹FT11-15A和3412厘米¹FT11-15B)和CH2拉伸乐队(约2921厘米¹)。主要分化的两个品种h . sabdariffa从第二部分开始,位于1850 - 1500厘米的范围¹有3单峰值不同高度。英国《金融时报》11-15A显示1794厘米的峰值¹并表示父尿嘧啶分子的计算频率分配δv (C = O),相同的峰值赋值(1792厘米¹)对英国《金融时报》第11 - 15 b两种h . sabdariffa示例显示峰值为1744厘米¹指的是拉伸的C = O也更与酯分子有关,即酰胺我FT11-15A的峰值(1630厘米¹)是5厘米¹不到FT11-15B。花青素标准的主要特征峰从面前的酰胺。因此两座山峰酰胺我样本与花青素峰值。四个花青素标准覆盖该地区1650 - 400厘米¹。进行识别,只有1到2山峰煎煮后的原料与光谱峰值匹配完全存在的花青素的重要内容之一h . sabdariffa。事实上,煎煮后的原料含有混合的出发。每个键的重叠延伸造成的平均峰值出现板下面,掩盖了许多伸展。大部分脂肪酸的主要代谢物组被发现在1500 - 1150厘米¹。在这种情况下,峰值为1404厘米¹FT11-15A 23厘米¹FT11-15B相比较少。另一不同的高峰是在1317厘米¹的FT11-15A 16厘米¹不到FT11-15B。糖部分开始从1150 - 400厘米¹表示类似的峰值模式和位置在两个样本。

水提物+组织:令人惊讶的是有很多差异的水提物和样品组织1%(图2)相比,唯一的水提物(谱图中未显示)。百分之一的组织研究中用于稳定花青素含量的目的。在该地区出现的峰高1500 - 1000厘米¹表示大多数极性化合物的吸收水和一些蛋白质仍保持在提取。红外光谱水提物+组织光谱表明FT11-15B小峰1672厘米¹没有出现在FT11-15A。通常情况下,在该地区FT11-15B分布式双峰值,而FT11-15A显示一个峰值相同的高度为1633厘米¹。最终该地区表示酰胺。因此,峰值为1672厘米¹实际上是来自相同的峰值在1630厘米吗¹,这意味着比FT11-15B FT11-15A更稳定的蛋白质条件在水提取。一个顶点在1196厘米¹FT11-15B表示振动组平面δ碳氢键不受水萃取FT11-15A相比,衍生了一个短的双峰值为1221厘米¹和1192厘米¹。额外的峰值为1143厘米¹在FT11-15B水提物+组织光谱证实了不同稳定条件的主要两个品种的花青素类黄酮含量h . sabdariffa。然而,这两个品种显示类似的多糖配置文件(峰值959厘米¹和956厘米¹)和维护这些化学组成在水提取。两个样本光谱显示几个山峰与delphinidin-3 -O-sambubioside和delphinidin-3 -O配糖体光谱。所包含的山峰1072厘米¹,1038厘米¹和721厘米¹。事实上,这三个峰没有出现在原材料光谱。这解释了水提取的能力提高花青素提取原始的内容h . sabdariffa。然而,1035厘米的巅峰¹水提物样品的光谱显示水平低于1072厘米¹,反对花翠素标准。从1192厘米两样品光谱的模式¹到1071厘米¹非常类似于频谱cyanidin-3 -O-sambubioside,除了明显的峰值1096厘米¹没有从这个花青素标准。只有1079厘米的峰值¹cyanidin-3 -O配糖体密切相关的样本。因此比较光谱是有用的在决定中花青素含量的存在h . sabdariffa样本。

2 dir同步和异步频谱

煎煮后的原料:图3模拟)提供了一个全面的化学调剖的煎煮后的原料。配置的概述在提取之前增强macro-fingerprint通过分子结构的现实。FT11-15A同步2 dir原材料煎煮后频谱比FT11-15B红点在1900 - 1000厘米的范围¹,他们分散在近四分之一的2 d光谱。这涉及至少70%的组件FT11-15A反应积极在热扰动和许多重叠的山峰被发现。同步2 dir频谱的比较,FT11-15B(图3 c),一个小红点区域位于右上角进行了分析。详细的解释表示FT11-15A 8汽车山峰而不是5 FT11-15B汽车山峰。此外,FT11-15A 15积极创建交叉峰和12 -交叉峰。重要的相关汽车峰值1814厘米之间的广场建成¹交叉峰(1716、1814)、汽车峰值1716厘米¹、交叉峰(1814、1716);汽车峰值1814厘米¹交叉峰(1504、1814)、汽车峰值1504厘米¹、交叉峰(1814、1504);汽车峰值1504厘米¹交叉峰(1400、1504)、汽车峰值1400厘米¹、汽车高峰(1504、1400);汽车峰值1504厘米¹交叉峰(1169、1504)、汽车峰值1169厘米¹、交叉峰(1504、1169)和各自最大的广场是汽车峰值1814厘米¹交叉峰(1169、1814)、汽车峰值1169厘米¹交叉峰(1814,1169)。峰的面积1814厘米之间的相关性¹,1716厘米¹,1504厘米¹和1169厘米¹代表了振动与羰基的功能摄动拉伸同时发生,振动酮酰胺二世乐队和苯的飞机可能在碳氢键弯曲。另一方面,FT11-15B显示3主要积极的交叉峰和他们分离相关汽车峰值1716厘米之间的广场¹交叉峰(1610、1716)、汽车峰值1610厘米¹、交叉峰(1716、1610);汽车峰值1502厘米¹交叉峰(1171、1502)、汽车峰值1171厘米¹交叉峰(1502,1171)。两个品种的差异在这个范围是2 dir FT11-15A有更多的活性成分,反应均匀,但FT11-15B显示只有少数活性成分的顶峰1675厘米左右¹在扰动。

FT11-15A水提物+组织:图4显示了2 dir同步谱FT11-15A水提物+组织在1900 - 1000厘米¹。有7个汽车峰(图4 b)沿对角线报道。峰汽车峰1795厘米之间的相关方¹交叉峰(1585、1795)、汽车峰值1585厘米¹、交叉峰(1795、1585);汽车峰值1795厘米¹交叉峰(1171、1795)、汽车峰值1171厘米¹、交叉峰(1795、1171);汽车峰值1585厘米¹交叉峰(1171、1585)、汽车峰值1171厘米¹、交叉峰(1585、1171);汽车峰值1710厘米¹交叉峰(1592、1710)、汽车峰值1592厘米¹交叉峰(1710,1592)是最活跃的网站自动峰强度最高。协会的相关方探索相关的组件中官能团的变化。野田佳彦定律2 dir解释包括同步和异步频谱。消除大多数的水提取物的主要代谢物,异步谱(图4 c)在相关协调。十字架在峰值(1169、1795)正同步谱但负在异步光谱,因此它可以被假定汽车峰值1795厘米¹有幸汽车前初始振动峰值1169厘米吗¹。

英国《金融时报》第11 - 15 B水提物+组织:有一些差异2 dir概要FT11-15B水提物+组织。图(4 d)提出了一个巨大的汽车峰值1814厘米之间的相关方¹(4 e),交叉峰(1167、1814),汽车峰值1167厘米¹和交叉峰(1814,1167)。每个主峰之间的相关性是负交叉峰打中间的角色。异步谱(图4)显示的反面图(4 e)。明确积极交叉峰(1167、1814)如图(4 d)变成负数交叉峰如图(4)所示。是很重要的,1814厘米的峰值¹为振动C = O组分配开始振动的峰值1167厘米紧随其后¹p-substitution集团指定为平面δ碳氢键、特色水提取物在热扰动。

花青素含量两组的量化h . sabdariffa样品使用软件“量化”

表4给出了定量的结果4种花青素FT11-15A和FT11-15B基于已建立的标准曲线。在这个小规模的分析,花青素含量的煎煮后h . sabdariffa原材料样品按照delphinidin-3数量- o-sambubioside, cyanidin-3- o-sambubioside, delphinidin-3- o配糖体最后cyanidin-3- o葡萄糖苷。煎煮后两个样品原材料证明所有的花青素含量的微小差异。0.0113毫克/毫升delphinidin-3 FT11-15A报道- o-sambubioside FT11-15B多,几乎相同的预测误差百分比。FT11-15A也更delphinidin-3记录- o比FT11-15B葡萄糖苷。另一方面,FT11-15B cyanidin-3含有0.0043毫克/毫升- o-sambubioside FT11-15A以上。Cyanidin-3- o葡萄糖苷的样本显示较低的差异和h . sabdariffa中花青素的含量最低的原材料样品。煎煮后结果表明,原料非常低的花青素被光谱学方法和可能是由于存在原料中的所有成分的混合物。这个场景很明显当比较cyanidin-3的数量- o-sambubioside煎煮后的原料和水提取+组织。花青素的含量与其他内容的混合h . sadbariffa和花青素的谱峰选择确定重叠与其他化合物结合。被水提取取消了大部分的不必要的内容尤其是碎片,纤维和探索第二代谢产品。因此,更高的水提取物花青素含量比煎煮后的原材料的检测。事实上,水提物+组织特别是来自FT11-15B delphinidin-3的最高金额- o-sambubioside。此外,预测误差百分比cyanidin-3的内容- o配糖体的水提物+组织比原始的1 - 5倍。这可能是由于极少量的这种类型的花青素相比其他花青素在样例本身或前和收获后的因素。有趣的是,在水提取,多数内容超过FT11-15A FT11-15B的花青素。

研究成功的两个品种进行比较h . sabdariffa来自Sabak Bernam,雪兰莪州使用两个阶段的红外光谱和2 dir相关光谱和量化的花青素通过高效液相色谱和光谱“量化”软件。煎煮后的红外光谱谱FT11-15B原材料报告包含波数从1500厘米高¹到1200厘米¹在FT11-15A相比,相同的官能团。实际上,FT11-15B原材料煎煮后的红外光谱谱得分相关性的0.990173 FT11-15A相比。尽管如此,FT11-15A显示酰胺的稳定我集团在其水提物。更杰出的光谱领域被注意到h . sabdariffa水提物由于花青素溶解度高。在2 dir频谱,FT11-15A显示积极的汽车峰和交叉峰散射的范围1900 - 1000厘米¹均匀,这意味着有更多的活性成分,而FT11-15B尤其是花青素含量。2 dir频谱的应用第二步增强两品种的歧视。

通常数量的组合方法建立了一个基本的预测其他的花青素h . sabdariffa样品从不同的位置。作为第一个运行与高效液相色谱法,最初开发数量的准确性。光谱的样品介质的原料或提取相应的高效液相色谱结果相一致。软件,结合两种不同的技术的优势和生产花青素的细节分析的决心。建立了样品h . sabdariffa标准曲线可用于其他位置花青素样本的预测。该方法使加速分析,随着花青素预测样本排除色谱法的步骤。这是一个解决方案,可用于大规模的分析样本,成本效益和节省时间。

两组样本都使用色谱法和两步成功歧视光谱学方法,表明两组样本中不同成分即使他们来自同样的位置。有可能是两种不同品种的可能性因素和条件前和收获后的样品处理。量化研究得出结论,这两个样本显示delphinidin-3量最高- osambubioside,其次是cyanidin-3 -O-sambubioside delphinidin-3 -O葡萄糖苷和cyanidin-3 -O葡萄糖苷。FT11-15A的花青素含量和FT11-15B随花青素的类型分析了使用相同的方法。

我们要感谢总经理的健康,马来西亚同意发表这篇论文,和医学研究所的主任(IMR),吉隆坡的支持这个项目。这项工作是支持的财务经济改革农业(EPP # 1),经济改革研究资助计划(nrg)(格兰特没有:NH1014D060)。

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