药理碳反水分抑制对马铃薯叶防御响应PhytophoraInfstans

Jolanta Floryszak-Wieczorek^一号Magdalena Arasimowicz-Jelonek^2*

^一号植物生理学系波兰波兹南生命科学大学Wolynska 35、60-637波兹南

²植物生态学系,波兰Umultowska 89,61-614波兹南

通讯通讯地址Magdalena Arasimowicz-Jelonek植物生态学系,Adam Mickiewicz大学,Umultowska 89,61-614波兹南,波兰

日期 :提交者:2017年1月9日;核准数 :2017年2月27日;发布日期:2017年3月3日

如何引用此文章Floryszak-Wieczorek J Arasimowicz-JelonekM药理碳反水分抑制对马铃薯叶防御响应PhytophoraInfstans.PlantSci Phytopathol2017年1:01-025
DOI:10.29328/journal.jpsp.1001002

版权许可:2017 Floryszak-WieczorekJ等金博宝app体育允许媒体不受限制使用、分发和复制, 前提是原创作品正确引用

碳反水合会EC4.2.1.1无处不在的金属合金,包括催化CO2和HCO3互换植物有三种CAs类型:A-CAs植物中CAs大都分布于citoplishm、clocplaststroma和mithocordria[2]碳化反水合金体在许多植物生理过程中发挥着关键作用,其中包括光合作用、呼吸、CO2传输和电解分解等[13]属最高效作用酶 分布范围极广发现CA参与管理colplastpH并保护Stroma酶在光条件快速巨变时避免折损[4]最广泛的研究专门研究β-CA对CO2聚积机制的参与情况,它增加这种气体在Rubisco附近聚积,并因此减少光阻[5]

详实记录显示CA高度表达叶组织并可代表叶中可溶性蛋白达1-2%[6]关键是Beca2和Beca3树叶中常用Ca基因[2]除固化二氧化碳外,据文献记录,β-CAs可能有助于植物在非生物压力条件下生存[8,9]可惜,由于缺乏深入研究,β-CA异形对植物适应盐类或osmothy应力的作用[10],这种无所不在的酶对植物防御生物因素的参与也没有很好定义

已知到目前为止,植物对病原体碳化反差的免疫作用非常重要,构成盐酸绑定3-SAB3[11]有趣的是,用过的aceta-colamide(已知CA抑制器)抑制试管内CA碳化活性以这种方式显示SA绑定和CA酶活性独立行为烟叶中CA基因表达停止抑制sedomonassyringae调试超敏感响应开发SABP3作用迄今尚未完全澄清,定义为抗氧化剂作用

文献记录ArabidopsisthalianaSABP3调控蛋白经历一氧化二氮代导Snitrosylation过程,导致强压CA和SA绑定活动[12]AtSABP3双重抑制废除了HR型免疫厂响应,这有助于反反馈循环调节厂防线[12]有趣的是,动物细胞的免疫响应可能不排除上述机制可能是病原体攻击策略的一个元素[13]

CA和SSABP2等式均指向Umytephthora infstans受感染时的Nitrosylation目标[14]值得指出的是,Hective马铃薯厂先前通过[15]发现NO附着碳化反水合物此外,[16].显示高温向日葵活动受蛋白催眠过程阻塞(Tyr205)nit蛋白质组方法识别CA自网Arabidopsisthaliana生理条件和病理条件下马铃薯问题分别由[17]和[1314]讨论

土豆悬浮CA显示有与P相容和不相容交互的独特表达模式ifestans[18]CA基因表达式高度调控6至24HPI发布互不兼容响应并趣味地同时CA基因互连调控先前曾建议CA可参与脂质生物合成[19],因此强抑制CA编程相容系统可能影响抑制与Jasmonate依赖路径或脂质代谢相联的基因并用烟变异者静默CA基因,[18]发现疾病进度显示CA抑制增加易感性Umycete病原体

CA参与启动对后应力的更强防波 先前记录由团队使用质组筛选(2D)和蛋白识别质谱工具[20]表示易腐土豆树叶Bintje用SAR导师处理显示对后续P有较强防御响应infstans压力[21]与CA蛋白表达式定期增量相关外延提供NO-distorations(S-nitrosoglutatione)发现NO-CA和CA之间可能的另一联系可能导致系统获取抗药性

在此背景中,发布数据说明CA在哺乳动物中发现NO合成的可能性似乎很有趣[22]发现前未知CA活动包括此酶与NO生成相消减nitrite应用CA碳化物活动抑制器时ACI和CAII以及动物组织提取物均从亚硝酸盐中获取NO可惜在过去几年里 没有其他研究组确认 NO合成新方法由CA管理

深入了解CA对植物防御响应的作用-迄今尚未完全澄清-我们用药理方法向马铃薯叶组织提供dorcolamide我们分析CA基因表达法笔录和蛋白活动水平P.非费斯坦斯NO生成和NO居中SA信号防御马铃薯Avr抗和Vr易感P.非费斯坦斯.

植物素材

两条马铃薯线Solanum管状LBintje和Bzura抗P.非费斯坦斯取自试管内组织培养并保留在无菌土壤植物院(16h/8h:日夜!180molm-2s-1

病原体文化并注射P.非费斯坦斯

PhytophhoraInfstansmont) de Bary (1.3.4.7.10.11.,celect MP946)从波兰M隔离MP946触发超敏感点细胞死亡土豆厂喷洒叶5毫升悬浮水量1.0x105/1毫升,然后隔夜保持100%相对湿度和18oC并转至生长室

疾病指数评估

受疾病症状影响区在P注射后4-6天对马铃薯叶进行评估imestans基础从I到IV[24],表示叶面积百分数受晚淡症状覆盖(I=1至5%!II=6-30%3+3+74=71至100%)阻抗性'Bzura'对avrP响应infstans接种表示树叶百分数与HR损耗

药理抑制CA活动

250mm解析dorzolamide抽取罐到-0.5巴5分钟后,停止阀门被释放叶子通过悬浮浮到dorzolamide解析法顶部以最小缺氧24小时后叶转至感染室并接受P防疫注射内试管内NO生成学解析dorzolamide

生成NO合成酶

确定试管内使用NO生成路径、反射和氧化NO源专用抑制器,即Tungstate(TG)、N-Nitro-L-arginine甲基盐酸阻塞NR活动时使用 0.1mmt试管内解析NOS合成路径因加5mmimioguanidine和5mmL-NAME而受到影响

测量一氧化二氮排放

流度解析法:FL-NO播色后马铃薯叶提取频度使用选择性一氧化传感器[25]铜复合FL(2-{2-Crolo-6-Hydroy-5-[2-ephenquinolin-8-ylaminoMe叶组织(500毫克新鲜权重)2ml10m提取量21,000xg四摄氏30分并立即使用100ml超导素作NO解析,将CuFL加到2m荧光分光度测定 Perkin ElmerLS50B每种值表示为NO-FL荧光强度

切敏学解析生成NO还使用Sievers-NitricOxidenoAlyzer 280i测量染色度解析叶组织(250毫克新鲜权重)2ml10m提取量在10,000xg四摄氏30分并立即向8mm磷酸钾缓冲区加400ml并注入300ml反泡沫代理物(30:1vgm-aldrich)清洗容器氮气源源化反应混合并释放NO连续注入亚硝酸剂量以及NR和CA抑制剂不干扰解析条件NO生成实时监控,表示为mV

电化学解析NO生成使用PGSTAT 30通用电化学分析器监控(EcoChemie,Utrecht和荷兰)叶提取中的NO代由微量脉冲反射法监测,并按[27]描述制作NO选择针型电极电化学测量使用微脉冲电压测量法

碳化反水合金活动

碳化反水分量由修改werbur-Anderson解析[28]确定叶组织(250微克新鲜重)为液氮同2mmHEPES缓冲值7.5同族体在15000xg上离心机30分钟获取超导体直接用于CA测量酶活动确定后,pH从0至1摄氏度从8.3下降至7.45超耗量(25ml)加2ml0.025mTris-HCl缓冲并添加1毫升CO2饱和蒸馏H2O76mm0-1oC反应混合常用3mlcvete并用pH微电子rode监控pH减法(HI108312Hanna工具)。倍增活动单位(U)计算取方程U=10x/T0酶活动表示为Uxmg-1蛋白Protein内容使用Bradford试剂测定

Gene表达式测量

RNA从150毫克冷叶组织中分离出RNA净化使用dexibonucle逆序转录自每个实验变异均用反转Aid处理^TM逆转轨迹工具箱(热科学)实时PCR由转转Gene 6000热回转器执行反应混合体中包含0.1微米,1微升5x稀释cDNA,10微l电源SYBRZ绿色PCR主机混合体(应用生物系统)和DEPC处理水总容量20l实时PCR响应条件包括95摄氏5度初始折叠化,随后为55周期,由95摄氏10度、53摄氏20度和72摄氏30度组成基因素数CA、PR1、NPR1和PAL转录积存表1数据归并参考基因编码延时因子和18S RRNA所有用入门设计使用Primer-BLAST[30]Ct值使用实时PCR矿工确定[31],相对基因表达法使用效率校正计算模型计算[32]

Dorzolamide对P.非费斯坦斯

测试dorcolamide对P.非费斯坦斯微粒生长标准pea-agar介质从介质割取四口水井后填充DA富集度如下:25微M、250微M和2.5M两周后按标准条件生长P.非费斯坦斯mycrium使用imageJ软件照相评估

统计分析

所有结果均基于至少三次独立实验,每个实验至少三次生物复制分析差值,用Tukey测试确定能力最小差P=0.05SigmaPlot11.0软件使用统计测试

CA对omyte病原体响应

与前几次报告[33,34]一致,结果显示接种后第一天的以下时段对HR执行或马铃薯-P减肥至关重要ifestans交互CA作用至今尚未完全清晰解析,infstans挑战注射

病原体的动能竞赛直到6hpi才引出CA记录积聚标注调控该基因(3倍加法)于6hpi记下,随后连续数小时CA记录量慢下降然而,48hpi则比未受感染马铃薯叶高(图1a)。反向响应中P.非费斯坦斯-potato交互CA基因表达式系统从1增加至6hpi值得注意的是,在6hpi最强CAMRNA级两种基因类型相似(图1a)。Dorzolamide应用前强抑制CA(约达80%)与马铃薯基因型对比P.非费斯坦斯播种植物(图1bc)

CA酶活动组成比易感型低近二倍(图1d)。马铃叶挑战配生病原体显示CA活动从6增加至24hpi,随后下降48hpi转折中 vrP.非费斯坦斯i24hpi触发增强CA活动但它随后在6hpi后下降(图1d)。预处理前DA有效抑制前6hpi内两个马铃薯栽培器中的碳酸CA活动

Dorzolamide加速NO信号生成马铃薯

二叉NO编队最近被团队发现防接种马铃薯[35]应用dorzolamide作为CA抑制器仅略微和暂时增加健康叶组织NO生产量(至6h)(图2)。反之,用CA抑制器提供并用病原体挑战的抗马铃薯叶显示高NO合成ifestans/抗马铃薯叶(图2a)。DA预处理易土豆显示前3hpi期间NO状态发生重大变化(图2b)。

dorcolamide和NO合成有效抑制器对HR响应期间NO早期爆破

自发现DA抑制碳酸CA活动在抗响应期间大大加速NO编译非费斯坦斯为此目的,我们测量3hpi在应用不同抑制器合成NO后对HR响应时的NO生产首创NO制作分析试管内依赖NO氟化Cu-FL并存:dorzolamid(DA)、tungstate(TG)和aminoguanidine(AG)与L-NAME单独或联合使用(图3)。Dorzolamide提高NO生成模型和avrP因费斯坦注射叶提取7%和16%反之,NO-FL荧光树叶受DA和Tungstate组合强压(52%),DA和AG用L-NAME强压(38%)比Avr无抑制树叶强压进一步确定亚硝酸盐能否在NO生物合成中起关键作用,向装有特定抑制剂的Avr注射马铃薯提取物(at 3hpi)提供100MNO2(图3)。配方叶提取补充DA和外源亚硝酸显示NO增产(25%)。出人意料的是,依赖NO烟雾最集中时,分析解法除DA和nitrite外,还含有TG,硝酸盐还原抑制器36%比Avr注射叶)

CA碳化物活动模式观察抑制时间与主机对病原体回答中增强NO生成值(at3hpi)相关联时,为进一步验证我们应用超敏感NO检测工具-SieversNitrode解析器-SietrodeAnalyzerNOA280i参考碳酸盐和亚硝酸盐结构相似性,上述作者记录CA使用亚硝酸作为基底,在规范条件下产生NO,以响应acetazolamide或dorzolamide抑制碳酸盐CA活动

所获数据显示,土豆叶提取物相继处理NR和/或NOS类活动抑制器(TG和L-NAME),继之以nitrite转而,当doroslamide(250微米DA)加入反应混合时,从avr提取的提取物中观察到高得多NOP.非费斯坦斯隐式叶子图4a-c

有趣的是,气相NO排放量在aver抗药性叶提取量中较高1a)比vr易感性1b) 植物均由tungstate、nitrite和DA组成解决方案只包含提高亚硝酸盐水平时,没有信号显示(FuareSupplation1c)

药理CA抑制对SA依赖防御

实时量化RT-PCR分析NPR1、PL1和PAL注入基因的表达度,以便更清晰地说明CA抑制对NO介质SA马铃叶防波路径的影响

NPR1早期调控与PR1基因表达法相适应见抗马铃薯(图5.6),而有效CA抑制处理显性阻塞NPR1和PR1mRNA转录积对比抗药性响应,在易感响应中发现NPR和PR1基因表达式延迟表达式24-48hpiDA提供提升NPR1mRNA水平为1至6hpi,但不影响PR1基因表达

两种类型交互作用中PAL表达式在接种后下一时点增加(图7)。CA抑制器应用没有修改 mRNA对PAL编码ifestans图7a值得强调的是,在易碎马铃薯中,顺序处理dorzolamideifstans高调PAL表达式(甚至7倍)记录为1-48hpi,而受感染DA非处理叶(图7b)。

阻塞CA活动并阻抗马铃薯P.非费斯坦斯

土豆叶渗透DA后再注射Avr病原体相对于AvrP.非费斯坦斯马铃薯系统无CA抑制器增速和迟发BlightHR相似点数目在两种处理方法中大相径庭,所以CA抑制不改变互不兼容交互中疾病开发

反之,实验显示晚薄症候发速,先向易腐土豆叶提供CA抑制器,再注射(图8a)。即预接触易失效马铃薯DA和后续挑战注射引起疾病限制并产生近似30%和50%下降 4和5天后P.非费斯坦斯分别处理晚数日发现这些实验组合之间的小分量差极强 突扰易染土豆叶组织

此外,我们观察到dorzolamide不同浓度不影响P子生长固化养分介质图2

多数对无处不在酶CA研究强调其在CO2固化中的重要作用,但CA异构体在植物细胞中也具有各种未探索功能的可能性越来越大。研究CA作用 植物适应生物压力 我们采行药理学方法 使用dorzolamide一开始我们发现各种剖分CA基因表达法对马铃薯叶相容和互容响应P.非费斯坦斯,与[18]结果一致获取数据显示二倍高CA活动并增强CA表达度从1至6hpi与病原体相容交互后hpimRNA记录记录与HR抗药性响应相比急剧下降,CA基因表达量峰值为6hpi并在随后的时段下降24-72hpi反之,[18]研究显示24-48hpi强烈抑制CA并恢复72hpiP.非费斯坦斯.

应当指出,与CA测高调低并参与植物对病原体响应有关的数据仍有冲突以CA基因抑制报告为主,内阿拉伯化互不兼容响应Alterria复古拉或处理后SA、MJ或Entene[36],番茄厂提供真菌毒素fusicocin[37]或易感染葡萄树Plasmoparaviti[38]遗传表达法与CA功能性活动的辨识偏差常归结为不同的植物-病原体系统,取决于病原体生物、接种时间、其他压力处理的持续时间、抗药性类型(R-抵抗、basal抗药性或SAR抗药性)或应用基因表达分析分子技术

氧化氮是一个重要信号分子,参与各种植物对开发与压力刺激的响应[39]最近发现马铃薯叶内含NO值显示在HR响应期间视时间增加NO二字性能, 早期强升3hpi和弱增24hpiNO高产第一个瞬态阶段似乎对确定抗应Avr病原体[35]很重要类似NO超产模式,第一高NO记录为1hpi,第二弱者6-8hpi在用avrP处理的大豆细胞悬浮中观察到syringae[40]小麦和Arabidopsis作者表示,早期压力诱导NO代可能在植物适应压力条件过程中发挥重要作用。

研究发现用dorzolamid提供马铃薯叶抑制碳酸CAP.非费斯坦斯接种时马铃薯Vr变异P.非费斯坦斯交互性结晶显示CA和NO之间的功能性新链路P.非费斯坦斯.如前文所示,NO可能双重调整CA活动,或可逆地附加cA的csteine残留物或不可逆CA蛋白消化[1314]

核电厂最大NO生成路径,但有越来越多的证据表明亚硝酸也可以通过NR独立路线转换为NO由CA管理并有dorzolamide的可能性NO合成曾由[22]哺乳动物记录值得注意的是,研究显示Avr注入土豆叶提取量(3hpi)补充试管内dorzolamide和50Mnitrite比Avr受感染者多出25%最强NO依赖荧光度比ca高36%与Avr注射叶比较,记录在含有dorzolamide和nitrite和TG的提取物中(图3)。

使用超敏感电化学、含氟度和染色光学技术的另一种实验方法显示,自抗基因型(3hpi)提取马铃薯,当有亚硝酸恢复NO释放时用tungstate处理,但在添加Dorzolami土豆提取自抗基因型(3hpi)显示NO排放量比易感型(3hpi)高得多(FigureSupplation)。S1).获取数据需要进一步详细研究,为依赖CA或独立NO生产马铃薯nitrite提供更多确定性证据应当指出,我们非常谨慎地处理这一发现,更何况是因为ABAIDOPSI重编蛋白引用海报展示显示测试缓冲区内没有任何CA抑制物并配有重组蛋白

当前缺少关于CA推广NO生物合成能力的不可辩驳数据并不排除NO和CA在马铃薯叶抗药性中的功能联系PhytophhoraInfstans.记录显示CA基因表达方式静默尼科迪亚安压缩avrsyringae模拟HR上叶[11]并增加易感性P.非费斯坦斯.[18].基于此声明,我们研究dorzolamide如何有效抑制碳酸CA活动,但不约束SA活动[11]P.非费斯坦斯.这套实验显示CA活动用抑制器减少了宿主防御基因表达方式,即NPR1,PR1并PAL语言在所有时间点接种时不攻克互不兼容交互期间的HR编程反之,易染土豆叶抑制CA活动有效延缓晚发病症状受 vrP注射后观察细胞死亡限制ifestans与NPR1基因表达法早期和微调相关联,并扩展MRNAPAL编码总体而言,所获数据表明CA碳酸盐活动下降改变了SA信号线,从而促进对Umyte病原体的有效玄武抗药

论文结果和其他公开数据可归纳为CA主要作用仍有待澄清假设CA主要位于叶板上(细胞活动总量的87%),在单片中发现重要活动(13%)[44]上文作者表示,如果我们计取每个区块的积分估计子细胞积分分别表示9.5%和3.4%的中素细胞容量[45],CA浓度比单片约高2倍虽然马铃薯CA异构体都显示免疫相似性,但单片异构体受光调节不等,这可能显示CA细胞作用比光合作用

归纳介绍结果显示CA异形非光合成函数抗马铃薯响应伴之以相对晚易感CA活动,而易感者反应则显示从疾病进化一度开始显著增强酶活动提前抑制CA碳酸盐活动dorzolamide加速NO发射和NO中介防御响应,包括上传SAQ信号路径事件序列促进有效响应vrPinfstans受马铃薯叶增强NO状态约束更何况试管内应用DA和有效抑制NO合成确认CA在马铃薯防御响应期间Dorzolamide显示的无释放使用NO专用微电机、荧光探针铜复合器和NO-化学光检测器独立监控马铃薯,但Dorzolamide还有可能影响其他未知NO合成路径未来需要综合遗传学和药理学方法调查CA活动的作用,特别是那些与NO中介马铃薯阻抗作用相适应的活动

作者非常感谢D博士Abramowski帮助确定一氧化二氮

这项工作得到了国家科学中心项目NoNCN2011/01/B/NZ9/00243

(补充元数)