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提交:2019年7月19日|批准:2019年7月31日|发表:2019年8月01

本文引用:李陆D,彭X,贾庆林年代,G,谭N, et al。碳酸酐酶我修改SOD1-induced运动神经元毒性果蝇通过ER应激通路。J >神经Disord。2019;3:135 - 144。
DOI:10.29328 / journal.jnnd.1001024

版权许可:陆©2019 D, et al。这是一个开放的文章在知识共享归金博宝app体育属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

关键词:碳酸酐酶1 (CA1);SOD1;肌萎缩性侧索硬化症;果蝇;运动神经元;内质网(ER)压力

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碳酸酐酶我修改SOD1-induced运动神经元毒性果蝇通过ER应激通路

影片,小鹏,Xuejiao贾Guiyi Li Na Tan甄,新竹范,小陈Liu Tatsuhiko Kadowaki和剑刘*

生物科学学院、西安交通、利物浦大学,苏州,江苏,中国

*通信地址:剑,生物科学,西安交通,利物浦大学,苏州,江苏,中国,电话:+ 86 512 8816 1655,+ 86 15150419088;1-602-596-2498;电子邮件:jian.liu@xjtlu.edu.cn;jjliusf@gmail.com

文摘
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背景:果蝇肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的模型已经广泛应用于理解ALS发病的分子机制作为治疗药物的发现潜在目标。铜/锌超氧化物歧化酶的突变(SOD1)引起增益ALS的有毒的功能和毒性在飞运动神经元。

结果:在这项研究中,我们已经确定,人类碳酸酐酶(CA1)可以缓解突变SOD1-induced运动神经元毒性的转基因ALS的飞行模式。有趣的是,我们发现,运动神经元的表达CA1可以独立诱导运动缺陷以及降低存活率。此外,CA1-induced毒性在运动神经元是脱水酶依赖性活动。从力学上看,我们发现这两个SOD1——CA1-induced毒性包括激活的eIF2αER应激反应通路。下游的激活物途径诱导毒性也被牵连。

结论:我们的研究结果证实,SOD1-induced飞运动神经元的毒性也包括内质网(ER)应力路径。更重要的是,我们发现了一个新的细胞CA1通过得罪突变SOD1-induced毒性中所扮演的角色运动神经元包括ER应激通路。这些信息可能有助于进一步理解疾病机制和发展治疗ALS的目标。

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AAZ:乙酰唑胺;肌萎缩性侧索硬化症:肌萎缩性脊髓侧索硬化症;歧视:家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症;萨尔:零星的肌萎缩性脊髓侧索硬化症;ASK1:细胞凋亡信号调节激酶1;ATF4:激活转录因子4;BSA:牛血清白蛋白;CA:碳酸酐酶;CA1:碳酸酐酶我;CAH1:果蝇碳酸酐酶形式1;CAH2:果蝇碳酸酐酶形成2;hCA1:人类碳酸酐酶1;CMT1A: 1型腓骨肌萎缩;DDS(直接数字合成;Derlin-1:退化在内质网蛋白1;dDerlin-1:果蝇在内质网的蛋白质降解1;hDerlin-1:人类退化在内质网蛋白1;DMSO:二甲亚砜;dsod:果蝇铜/锌超氧化物歧化酶基因;E106I:人类CA1突变与氨基酸的突变位置从106谷氨酸(E)异亮氨酸(我);eIF2α:真核翻译起始因子2α亚基;p-eIF2α:磷酸化真核翻译起始因子2α亚基;呃:内质网;付:融合在肉瘤,rna结合蛋白;G93A:人类铜/锌超氧化物歧化酶基因突变与氨基酸的突变位置从93甘氨酸(G)丙氨酸(a);GFP:绿色荧光蛋白;HNPP:遗传与责任压力麻痹神经病变;Hsp70: 70 kDa热休克蛋白;物:c-Jun n端激酶; p-JNK: phosphorylated c-Jun N-terminal Kinases; PFN1: Profilin 1;PMP22:周围髓Protein-22;SOD1:铜/锌超氧化物歧化酶;SOD1G85R:人类铜/锌超氧化物歧化酶基因突变与氨基酸的突变位置85从甘氨酸(G)、精氨酸(R);dSOD1:果蝇铜/锌超氧化物歧化酶;hSOD1:人类铜/锌超氧化物歧化酶;TBST: Tris-Buffered盐水,pH值7.5,0.05%渐变20;TDP-43:焦油dna结合蛋白;2 TRAF2: TNF Receptor-Associated因素;XBP1: x - box结合蛋白1;CA1苍蝇:转基因果蝇表达人类CA1运动神经元;E106I苍蝇:转基因果蝇表达人类CA1突变E106I在运动神经元;GFP苍蝇:转基因果蝇表达GFP在运动神经元;SOD1苍蝇:转基因果蝇表达SOD1G85R突变体在运动神经元;CA1 + SOD1苍蝇:人类CA1和SOD1转基因果蝇表达G85R突变体在运动神经元

介绍
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肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)是一种成人运动神经元疾病的特点是主要的脊髓运动神经元的损失,脑干和运动皮层[1]。超过90%的ALS零星(SALS),约10%是遗传的。根据最近的评论文章,共27个基因与不同的功能已上市与家族性肌萎缩性侧索硬化症(歧视)[2]。ALS发病机制非常复杂,涉及许多球员和途径[3]。最近,据报道,人类碳酸酐酶(hCA1)可能是一个球员在ALS病理学作为其水平增加脊髓运动神经元的ALS患者包括SALS和歧视[4]。碳酸脱水酶(CAs)催化二氧化碳和水的可逆转换碳酸氢盐和质子是最重要和基本的过程在细胞新陈代谢[5]。中科院负责动态调节和维持细胞内和细胞外的pH值[6]。已知CA1 17哺乳动物CAs的胞质亚型之一出现在几个亚细胞车厢[5]。除了表达红细胞,几种类型的上皮细胞、滑膜,和心脏毛细血管内皮细胞,CA1表达式也发现人类脊髓运动神经元的[4]。在果蝇中科院,有两种形式CAH1和CAH2 [7]。系统发育分析表明CAH1中科院和哺乳动物的胞质形式共享一个共同的祖先,而CAH2与细胞外的共享一个共同的祖先CAs [7]。果蝇CAH1(dCAH1)股价44.6%身份hCA1整体氨基酸序列(图S1)。飞CAH1表达式中可以检测到唾液腺,中肠和后肠、眼睛和大脑[7]。击倒的飞CAH1在中肠导致更少的酸环境中[8]。更重要的是,发现CA1水平变化在一些病理条件包括炎症、癌症和脑损伤(9到18)。然而,CA1可能扮演的角色在运动神经元在生理和病理情况下是完全未知的。

铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)是第一个发现于1993年,负责20%的基因歧视[19]。大量的信息已经在动物模型中获得SOD1-linked ALS以及在体外哺乳动物细胞。它已经建立了突变SOD1s引起肌萎缩性侧索硬化症占主导地位的方式获得的毒性作用而不是失去酶活性(20、21)。一个绝大的数据来支持这种获得的毒性是超过130突变SOD1s选择性地与人类交互Derlin-1 (hDerlin-1),而野生型SOD1不[22]。此外,SOD1突变体的获得毒性机制的激活内质网(ER)应激反应导致捕获细胞凋亡信号调节激酶1 (ASK1)聚合紧随其后的是下游c-Jun n端激酶(物)的激活途径[23]。的果蝇SOD1-linked模型在运动神经元毒性还建立了[24]。尽管SOD1基因是高度保守的许多物种中,果蝇SOD1蛋白质(dSOD1)股价61%的身份与人类SOD1 (hSOD1) [24]。此外,超表达野生型或ALS-linked突变hSOD1s飞运动神经元是有毒的,而过度的果蝇SOD1基因(dsod)不是[24]。应激反应的Hsp70激活神经胶质与毒性相关的报道是[24]。类似的发现在老鼠[20],dsod零苍蝇有缺陷但不容易展示ALS-like表型[25]。有趣的是,果蝇敲入hSOD1突变模型报道[25]。苍蝇敲入纯合子dsod含有相当于人类ALS突变是致命的,而苍蝇杂合的同样的突变基因敲入展出ALS-like病理以隐性的方式[25]。因为突变SOD1s行为在人类主导的方式,我们决定用动态模型的ALS过多表达肌萎缩性侧索硬化症(SOD1突变形式G85R)最初被沃森et al。[24]我们的研究。为了理解在ALS CA1病理学的角色,我们决定是否SOD1-induced飞运动神经元的毒性可以修改hCA1的存在。我们也作出以下假设:1)SOD1-induced损伤的分子机制飞运动神经元可能通过Derlin-1 ASK1物通路;2)如果CA1可以修改过程,它也意味着一个新的角色第一次CA1可能在运动神经元。

材料和方法
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质粒结构

互补脱氧核糖核酸对人类CA1从Genscript购买(克隆ID: OHu24513,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。的E106ICA1通过定点诱变产生的突变形式的通过两轮PCR被莫汉蒂等。[26]。简单,总共4 pcr引物的设计和使用。引物的序列是:F1:

5“-TACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3”;R1: 5 ' -

TGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ';F2:

5“-GAGCATGGTTCAatcCATACAGTGGATGG-3”;和R2:

5“-ATCCACTGTATGgatTGAACCATGCTCATT-3”。

引物的核苷酸序列在较低的情况下F2和R2表示核苷酸突变会导致改变氨基酸谷氨酸(E)和异亮氨酸(I) 106氨基酸poistion CA1肽。最后的片段PCR是纯化和克隆到pcDNA3.1(+)和突变经测序。互补脱氧核糖核酸的CA1或E106I我被克隆到Xba和Kpn的pUASTattB质粒进行转基因果蝇。

飞菌株和十字架

苍蝇是维护和年龄标准介质(8%啤酒酵母蔗糖/蛋白胨酵母提取物2% / 2% / 3% / 6% / 0.05%葡萄糖MgSO4/ CaCl2/0.6%丙酸0.05% / 1%与1%琼脂)甲基4-hydroxybenzoate 25°C 12小时的光暗周期。携带UAS-GFP转基因线。S65T (RRID: BDSC_57064), UAS-SOD1G85R(RRID: BDSC_33608)、D42-GAL4 (RRID: BDSC_8816)从布卢明顿获得果蝇股票中心(美国BDSC,布卢明顿)。转基因果蝇携带UAS-CA1(野生型CA1)和“无人飞行系统”E106I(CA1)的突变形式是由最好的基因公司(奇诺冈、钙、美国)。纯化pUASTattB包含互补CA1或质粒E106I突变体被用于PhiC31标准计划,使转基因果蝇(www.thebestgene.com)。注入8622 (http://flybase.org/reports/FBst0008622.html)的股票attP23号染色体的l是用于UAS-CA1和无人机E106I转基因产品。D42 > GFP。S65T D42 > CA1, D42 > CA1E106I,D42 > SOD1G85R苍蝇与UAS-GFP跨越D42-GAL4生成。S65T UAS-CA1,“无人飞行系统”——CA1E106I和UAS-SOD1G85R苍蝇产生F1后代将被描述为GFP, CA1,E106I在本文,SOD1苍蝇。转基因线纯合子转基因UAS-CA1和D42-GAL4第三染色体重组产生的。转基因果蝇表达CA1和SOD1(称为CA1 + SOD1苍蝇在本文)是由穿越D42-GAL4: CA1 UAS-SOD1G85R。

爬行的测试

第三龄幼虫被用于抓取测试进行的25°C。解剖显微镜配备了摄像头,DDS函数发生器和计算机被用来形象幼虫运动运动1%琼脂糖凝胶表面10厘米菜一起在一个黑色背景下统治者的引用。一个幼虫被从琼脂糖凝胶上的瓶,让它适应环境2分钟之后,它的运动被相机在ImagePro软件使用一个定制的宏命令。视频图像是通过提前收集图片每隔0.5秒总段100秒。幼虫在板上的立场是手动跟踪和其运动的总爬行距离校准使用引用校准曲线。

登山化验

雄性苍蝇的F1后代从正确的基因型包括GFP, CA1、SOD1和CA1 + SOD1苍蝇收集羽化后24小时内,指定为第1天苍蝇。共有10个雄性苍蝇收集在一个瓶。登山分析是根据罗梅罗描述的方法进行et al。[27]。,2天,苍蝇在每个瓶被转移到一个干净的瓶5厘米线从底部的标记。能适应测试瓶后5分钟,苍蝇被利用到瓶的底部和苍蝇的数量攀升至5厘米线至少在18秒记录一次。这表现为每个瓶重复两次。攀登指数计算的平均三个记录数除以总数量的苍蝇在每个瓶。当没有苍蝇还活着在瓶,攀登指数瓶不再存在,时间点和时间点。苍蝇都是测试每三天,从38天2天,瓶的全部数据从不同的独立实验和分析相结合。测试后,苍蝇被安置在一个新瓶新鲜生长介质。

测量的生存

生存的速度也是测量中使用的苍蝇爬测试每三天,活着苍蝇的总数记录测试一天。生存的速度被记录计算飞行测试天除以总数量上的苍蝇数量为每个瓶第一天。一旦没有苍蝇还活着一个瓶,瓶的存活率达到零,零之后所有的时间点。数据从所有瓶不同的独立实验相结合,用于使生存曲线。

免疫印迹分析

测定转基因表达苍蝇是由从个体中提取蛋白质飞使用1 x示例加载缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值6.8 /β-mercaptoethanol 2% SDS /甘油10% / 1% / 0.02%溴酚蓝)。总共3随机收集苍蝇为每个交叉测试。检查水平的改变蛋白质参与病理进行了使用切割头和躯干的材料。组织中均质裂解缓冲包含20毫米Tris-HCl (pH值7.5)/ 12毫米β-glycerophosphate / 150毫米生理盐水/ 5毫米EGTA / 10 mM氟化钠/ 1% Triton X-100/1%脱氧胆酸盐/ 1毫米德勤/ 1毫米原钒酸钠,和1 x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国马ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)。同等数量的苍蝇是用于每个时间点。蛋白质样品分离SDS /页面凝胶,转移到硝化纤维膜和探测所需的抗体。膜被牛奶或BSA在TBST,初级抗体孵育,水洗,二级抗体孵育,再洗。照片被收购奥德赛和数据使用图像Studio Lite版本5.2软件进行了分析。

Co-immunoprecipitation

头部和胸腔飞的切割,用于co-immunoprecipitation (co-IP)。蛋白质提取相同的裂解缓冲用于免疫印迹分析均质化的组织和后上层清液microcentrifugation最大速度为30分钟4oc蛋白浓度测定采用BCA法(美国马ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)。Co-IP进行IP缓冲区(20毫米三羟甲基氨基甲烷/ 150毫米氯化钠液1% Triton, pH值7.5)的比率5µg: 1毫克抗体和蛋白,分别。IP体积是350µl和蛋白质与蛋白质G端珠子(美国通用电气医疗集团,匹兹堡,PA)为2小时4oC,其次是孵化与IP抗体在一夜之间在4o三次c .珠子是用IP缓冲之后,最后一个洗1 x PBS。上层清液的一小部分和珠子上的所有蛋白质受到免疫印迹分析。

抗体

从ProSci GFP抗体(xr - 9001,业务、钙、美国)。SOD1抗体用于免疫印迹分析从恩佐生命科学(adi - SOD1 - 100法明岱尔,纽约,美国),一个用于co-IP是徕卡生物系统(NCL-SOD1、纽卡斯尔、英国)。σ的肌动蛋白抗体(A2066,圣路易斯,密苏里州,美国)。CA1抗体(ab124976,用于免疫印迹;ab54912用于co-IP),微管蛋白(ab52866)来自Abcam(伯林盖姆、钙、美国)。只抗体检测磷酸化eIF2α(CST # 9721)和物(CST # 9251)从细胞信号技术(美国马Davers)。特定检测抗体果蝇Derlin-1但不是人类Derlin-1生成通过多克隆抗体的抗原决定基序列RAPPRQATESPWG由GenScript(中国南京)。证实了抗体的特异性表位肽竞争实验利用苍蝇和人类的蛋白质样品。

统计分析

统计分析了使用学生学习任务或GraphPad棱镜8软件。

结果
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在幼虫阶段CA1造成运动神经元毒性和成人

为了理解CA1能否调节突变SOD1-induced毒性,我们首先检查运动功能在转基因果蝇表达hCA1运动神经元的二进制表达系统D42-GAL4[28]和UAS-hCA1(见材料与方法)。这些苍蝇将被描述为CA1苍蝇在这项研究中。爬行的运动功能是测量距离和攀登指数在幼虫阶段以及在成人中,分别。此外,生存的速度也决定。免疫印迹分析蛋白质的个人飞行证明各自的转基因表达GFP和CA1飞运动神经元容易检测到的抗体(图1,GFP & CA1)。使用第三龄幼虫生长在爬行的常规介质测试,发现CA1幼虫爬100秒的平均距离明显短于GFP幼虫(图1 c),表明有一个运动缺陷造成的表达hCA1飞运动神经元在幼虫发育。运动行为测试也在成人CA1苍蝇通过经典anti-geotaxis测试每3天开始第二天羽化后直到38天。攀登指数被定义为苍蝇的数量的比例达到了标志着18秒5厘米的距离至少一次瓶,这是作为运动活动的迹象。发现由CA1苍蝇爬指数表现出显著低于GFP苍蝇早在第八天(图2)。CA1苍蝇爬指数继续下降大约30.5%,而GFP苍蝇保持平均爬索引值的57.5%天38(图2)。 In other words, the locomotion activity in CA1 flies was about half of that of GFP flies between week 5 and week 6 in adult life. Consequently, CA1 flies had also shortened lifespan demonstrated by the reduced survival rate in the same period of time (Figure 2d). Therefore, we conclude that for the first time we have demonstrated that hCA1 when expressed in fly motor neuron can cause toxicity as reflected in the locomotion defect as well as the reduced rate of survival in adult flies.

CA1-induced运动神经元毒性是活动依赖性

我们有兴趣问的下一个问题是是否观察到CA1-induced毒性要求酶活性。为了解决这个问题,转基因果蝇表达突变形式的CA1 (E106I)与保守氨基酸残基的突变Glu106建立了运动神经元。突变在Glu106灭活CA[29]和酶活性的丧失E106I也证实了碳酸酐酶活性测定(图S2)。突变E106I表达式是由相同的CA1抗体检测单个果蝇(图1,道6 - 9)和水平E106I突变蛋白有点低(大约70%的野生型CA1)相比,CA1表达式(图1 b)。此外,CA抑制剂乙酰唑胺(AAZ)也包括在飞生长培养基作为替代的方法灭活的脱水酶活动第三龄幼虫爬测试(图3 a-3c)。DMSO中增长媒体AAZ只溶于DMSO溶液。而DMSO对减少运动活动没有任何影响在3日龄CA1幼虫与GFP苍蝇(比较图1和图3 c), AAZ两个不同浓度的1µM或者10µM消除这种缺陷在CA1幼虫(分别为图3 b和c)。同样,幼虫表达E106I执行没有不同于GFP幼虫爬行距离,扭转缺陷在CA1幼虫(图3 d,比较紫色和绿色)。脱水酶依赖性活动的毒性也爬试验测试和存活率在成年苍蝇。的E106I苍蝇,实际上表现的GFP苍蝇一样爬指数(图2 c)和存活率(图2)与CA1苍蝇相比(图2中,比较了2 a和2 b攀爬的指数;并比较与2 e 2 d存活率)。因此,我们得出这样的结论:CA1-induced毒性飞运动神经元需要脱水酶的活动。


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图1:确认转基因表达的转基因果蝇和CA1-induced运动缺陷在幼虫阶段。转基因表达的免疫印迹分析单个果蝇表达GFP转基因行,CA1和E106I。每个车道代表一个飞巷是标签上面的数字图像。污点是探测与GFP抗体(通道1 - 3)和CA1和肌动蛋白(第4 - 9道)。这里使用的CA1抗体检测E106I突变体。MW标准表示的数字kDa右边的图像。b)的定量的CA1和水平E106I在转基因果蝇突变表达。c)的散点图爬行距离测量在3日龄GFP和CA1幼虫生长在普通媒体。幼虫的数量用于每个小组用“n”表示。p值由单向方差分析分析使用非参数和Mann-Whitney测试。冲黑色线条代表意味着±SE。“*”是用来表示p < 0.05。


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图2:运动神经元表达依赖性活动运动缺陷引起的CA1和生存在成年苍蝇的速度减少。成年雄性苍蝇表达GFP转基因线(绿色),野生型CA1(红色)和突变E106I(紫色)受到攀登(a - c)和生存(d-f)测试从羽化后第二天到38天。飞瓶用于测试的数量对于一个给定的两组在每个时间点由“N”表示。十天苍蝇收集每个瓶1。每个图的数据分析了双向方差分析Bonferroni紧随其后的多重比较使用GraphPad棱镜的软件进行测试。两组之间的差异的重要性是由旁边的p值表示图中“N”领域“*”是用来表示p < 0.05。两个数据点之间的意义在给定的时间也贴上了“*”:*:p < 0.05;* * * * *:p < 0.01, p < 0.001;和* * * *:p < 0.0001,位于上面图中的每个数据点。数据值和误差代表意味着±SEM。


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图3:运动神经元的表达缺陷引起依赖性活动运动CA1第三龄幼虫。爬行的散点图的距离以3龄幼虫。爬行的测试进行了从转基因果蝇三龄幼虫表达GFP(绿色),CA1(红色)E106I蛋白质。生长介质包含DMSO (a)和不同浓度的乙酰唑胺(AAZ)抑制剂CA1都包括在内。b) AAZ 1毫米;c) AAZ 10毫米;d)常规的媒介。幼虫的数量用于每个小组用“n”表示。p值由单向方差分析分析使用非参数和Mann-Whitney测试。冲黑色线条代表意味着±SE。“*”是用来表示p < 0.05。

CA1可以改善SOD1-induced毒性的早期成年苍蝇

为了理解SOD1——之间的关系和成年苍蝇CA1-induced运动缺陷相关FALS-linked运动神经元毒性的机制,我们还创建了转基因果蝇表达SOD1和CA1在运动神经元(称为CA1 + SOD1苍蝇)。攀爬和生存进行了测试共有四个转基因果蝇表达GFP, CA1、SOD1和CA1 + SOD1。上述利益转基因的表达在每个转基因飞线证实了免疫印迹分析(图4)。SOD1 (SOD1突变形式的表达式G85R)引起的毒性在攀登测试到第14天(图5)。然而,这SOD1-induced毒性趋于稳定,达到了显著的有益效应与GFP苍蝇在天38(图5)。相比之下,如前所述,CA1持续运动机能下降而引起的GFP苍蝇(图2)。有趣的是,当CA1表示除了SOD1飞运动神经元,运动活动在CA1 + SOD1苍蝇恢复控制的GFP苍蝇(图5 d和图S3C)。这CA1-rescuing SOD1毒性和“恢复正常”是最明确和清楚地观察到在前2周或天14 b(图5和图S3A)。救援效果是双刃的在某种意义上获救SOD1也显著CA1-induced毒性,证明了p= 0.003,在CA1和CA1 + SOD1苍蝇在同一时间(图5 c和图S3B)。后期的成年苍蝇的生活,尤其是在26天,SOD1-induced毒性趋于稳定而CA1继续被有毒(图5 e),前者是主导,后者消除CA1-induced毒性完全没有不同于GFP苍蝇(图5 c和5 d)。这上面语句和增强的p值是一致的(p< 0.0001)之间SOD1和CA1 + SOD1苍蝇14天内(图S3A)p38天内= 0.0402(图5 b),而p值CA1和CA1 + SOD1苍蝇表现出反向趋势:p= 0.003,p分别在14和38天,< 0.0001(图5图S3B和c)。


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图4:确认四个转基因表达的转基因线。蛋白质免疫印迹分析从单个果蝇表达GFP转基因线(通道1 - 4),CA1(道5 - 10),SOD1(11 - 16车道),和CA1 + SOD1(车道17-22)在运动神经元。MW标准是由数字表示kDa的图像。污点是探测与GFP抗体(a), CA1 (b), SOD1和CA1 (c)。所有的屁股也探测anti-tubulin抗体。*表示样本中的蛋白质15太低由于实验变化。


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图5:从2天课程的时间(38)的运动活动以4种不同的转基因果蝇。成年雄性果蝇的攀登测试进行转基因线表达控制蛋白GFP(绿色),CA1(红色);SOD1(橙色)和CA1和SOD1 (CA1 + SOD1,蓝色)。每一个图展示数据的比较从两个组:a) GFP和SOD1;b) SOD1和CA1 + SOD1;c) CA1和CA1 + SOD1;d) GFP和CA1 + SOD1;d) SOD1和CA1。测试中使用的瓶数苍蝇对于一个给定的两组在每个时间点由“N”表示。为每个瓶收集十个苍蝇在第一天。 Data for each graph were analyzed by two-way ANOVA followed by Bonferroni’s multiple comparisons test using the GraphPad Prism software. The significance of the difference between the two groups was indicated by the p value next to “N” in the graph area where “*” is used to indicate p < 0.05. The significance between two data points at a given time was also labeled by “*” in which: *: p < 0.05; **: p < 0.01, ***: p < 0.001; and ****: p < 0.0001, situated above each data point in the graph line. The data values and error bars represent Mean ± SEM.

ER应激通路参与SOD1 CA1-induced毒性

由于事实显然是SOD1之间的串扰,CA1-induced运动神经元毒性在成年苍蝇,我们第一次测试的可能性是否存在一个直接或间接的互动SOD1和CA1 co-immunoprecipitation从飞组织使用蛋白质。我们没有发现一个潜在的使用这种方法的两个蛋白质之间的相互作用(图S4)。与哺乳动物细胞研究已经证实几乎所有突变SOD1s可以获得毒性的异常与Derlin-1交互诱导ER压力导致聚合物的形成和活化ASK1 [23]。此外,ER应激反应是最早的病理特征之一变异SOD1-linked歧视在啮齿动物模型[30]。确定SOD1-induced运动神经元毒性在果蝇可能涉及类似的机制,我们假设SOD1基因突变也会相互作用果蝇Derlin-1 (dDerlin-1)序列中确定hDerlin-1与突变SOD1s股票与相应的序列同源性dDerlin-1(图S5A)。然而,co-immunoprecipitation实验没有取得积极两种蛋白质之间的交互使用纯化蛋白质(数据未显示)或从飞组织蛋白质(图S4,底板;图S5B和S5C)。然而,分子水平的变化,调节在ER应激反应检查(图6)。这样的分子是eIF2α之一,其通过磷酸化激活(p-eIF2α)。颞p-eIF2α监管水平测定在转基因线在第三天,14天,26天。第一次,我们记录了早期和峰值激活第三天的eIF2αSOD1苍蝇(图6 b,橙色酒吧),平息水平不不同于GFP苍蝇在第14天(图S6A,第14天,绿色和橙色酒吧)。这是支持这一概念,ER应激通路已知参与哺乳动物细胞[23],还参与突变SOD1-induced毒性果蝇,后者还没有被证明。不同,延迟激活eIF2α在CA1苍蝇第三天开始增加,但在第14天达到高峰(图6 b,第14天,红条;图S6A,第14天,绿色和红色酒吧)。相比之下,没有检测到激活eIF2α在CA1 + SOD1苍蝇与GFP苍蝇(图6 b,蓝色酒吧),这表明eIF2α激活可以作为指示潜在的机制,导致CA1 -的反作用的效果和SOD1-induced毒性观察到成年早期飞(图5)。

CA1 - SOD1-induced毒性包括物激活

了解细胞凋亡水平的毒性,磷酸化的变化物(p-JNK)也被检查。类似的激活物14天观察CA1和SOD1苍蝇(图6 c,红色和橙色酒吧),又没有看到在CA1 + SOD1苍蝇(图6 c,蓝色酒吧)。这是符合正常运动功能观察在CA1 + SOD1苍蝇爬测试直到第14天(图5)。物的激活在CA1苍蝇天26没有明显不同于第14天(图6 c,无显著差异之间的红条14和天26),而在SOD1苍蝇的激活物明显减少26与天14(图6 c,橙色的酒吧,p= 0.03天14至天26)。这些变化与持续运动缺陷在整个时间进程CA1缺陷行为稳定并最终改善SOD1苍蝇相比GFP苍蝇后第14天(图2和图5)。


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图6:定量磷酸化水平的eIF2a和磷酸化物表达GFP转基因线(绿色),CA1(红色),SOD1(橙色)和CA1 + SOD1(蓝色)在第三天,14岁,26岁。)免疫印迹分析蛋白质的飞头和躯干使用磷酸化抗体eIF2a (p-eIF2a)磷酸化物(p-JNK)和微管蛋白。每个车道包含蛋白质从10个人苍蝇。图表展示时间变化p-eIFa (b)和p-JNK (c)为每个转基因线所示。蛋白信号的强度在每个车道使用图像量化Studio Lite版本5.2软件和规范化的微管蛋白的水平。p值计算使用之间的学生学习任务和标记2酒吧里用“*”p < 0.05。数据值和误差表示平均数±标准差。

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我们的研究首次小说飞模型特征的运动神经元毒性可能与ALS。之前发现的人类CA1的水平是提高ALS患者的脊髓[4],现在已经证明,当在飞运动神经元也有毒& 2 d(图2)。在建立果蝇模型ALS-linked基因、5分子包括SOD1 TDP-43,付家和PFN1,当他们的野生型人类蛋白质在飞神经元毒性(31、32 24)引起的。显然,CA1表现类似于这五个分子。我们的方法在努力了解CA1如何调节运动神经元功能是看它如何可能影响一个已知ALS-related表型人类突变SOD1-induced飞运动神经元的毒性。指出这个SOD1-induced毒性观察在我们的研究中(图5)比早些时候公布的数据[24]。这种差异可以归因于不同的控制实验中使用。而苍蝇overexpressing内生飞SOD1爬测试使用了沃森et al。[24],我们用苍蝇overexpressing GFP在我们的研究中。肯定是CA1-induced毒性之间的串扰和SOD1-mediated通路所展示的数据在图5中。这个相声的最终结果是两个毒性的逆转正常,暗示个体毒性的机制可以互相抵消。这样的救助效果的类似性质的研究发表在轴突运输的缺陷引起的动力蛋白的突变完全拯救SOD1突变G93A-induced赤字在轴突运输ALS的转基因小鼠模型,即使分子机制并不完全清楚[33]。从理论上讲,至少有两个潜在的可能性等交互。 One is that there might be a shared and rate-limiting factor in the CA1- and SOD1-induced pathways. When both proteins are present, the amount of this factor is rendered to be insufficient for either pathway resulting in the disappearance of the toxicity. Second, there is a common factor or pathway affected by CA1 and SOD1 and for the normal cell function, the level of this factor or the active state of this pathway has to be maintained at an optimal value. An example of such factor is peripheral myelin protein-22 (PMP22严格监管)的水平。PMP22是髓鞘的一个组成部分,它涵盖神经和负责有效神经冲动的传导。水平的提高PMP2由于额外的副本PMP22基因导致神经错乱称为1型腓骨肌萎缩(CMT1A),同时降低水平PMP22由于基因的杂合的删除会导致不同的神经障碍被称为遗传神经病变与责任压力麻痹(HNPP)。如果CA1引起的变化因素的水平或程度的积极途径向一个方向,虽然SOD1相反的方向,这可能导致破坏的正常功能。当蛋白质存在,反对对变化的影响因素/通路的简历的最优水平条件和正常的细胞功能。还需要进一步的调查来阐明这个复杂而有趣的现象的机制CA1和SOD1-induced毒性之间的串扰。

CA1可以修改SOD1-induced毒性测试了假说是否可能有一个共同的信号通路导致运动神经元功能障碍。尽管SOD1之间的物理相互作用和dDerlin-1并不在我们的研究中发现,我们证明了ER应激反应通路被激活涉及eIF2αSOD1的苍蝇。这是与哺乳动物细胞中的数据一致,ER应激ASK1激活突变负责SOD1-linked毒性[23]。完全有可能,SOD1基因突变可以身体接触dDerlin-1瞬态和/或监管的方式(这不是被co-immunoprecipitation方法)导致毒性、或有dDerlin-1-independent信号通路。另一方面,同样有可能的是,SOD1-induced毒性在dDerlin-1-independent飞运动神经元。此外,相同的激活eIF2αCA1-induced中发现缺陷,但在稍后的时间而达到顶峰,到SOD1(图6 b,比较红色和黄色酒吧)。早换句话说,一个ER应激反应可能是至关重要的在确定神经元是否能克服或屈服于压力。事实上,似乎越快eIF2α帮助SOD1神经元的激活在长期生存压力(图5),而相对延迟eIF2α激活CA1苍蝇导致持续的毒性在运动神经元(图2)。这种类型的相关性的ER应激反应和细胞生存也报道了沃尔特et al .,关于动力学XBP1拼接和ATF4翻译和细胞死亡的相关性[34]。物通路是在对压力的反应和激活果蝇,激活物通常是与细胞凋亡相关[35]。也知道ER应激会导致激活物通过TRAF2和激酶复杂包括ASK1。增加p-JNK水平观察在CA1和SOD1 Day14苍蝇,这可能与eIF2a激活有关。然而,没有明显的发现物激活在CA1 + SOD1苍蝇,这和缺乏运动是一致的缺陷在这些苍蝇,表明毒性在果蝇可能由于ER应激反应和下游物信号通路的激活。指出CA1和SOD1苍蝇表现出低水平的激活物的第三天,天26与GFP苍蝇(图S6B)。目前还不清楚什么导致这种低水平的p-JNK CA1或SOD1苍蝇。可以推测,初始CA1 -和SOD1-induced压力可能会降低p-JNK前提细胞水平更好地应对进一步激活。如果是这样的话,这一事实的p-JNK CA1 + SOD1苍蝇显著低于CA1或SOD1苍蝇在26天(图S6B比较蓝色红色或橙色酒吧)将符合两条途径之间的反抗相声导致更好的应对机制。这些纯猜测未来的调查。

总而言之,我们的研究首次证实,SOD1基因突变能引起ER应激反应和物激活飞运动神经元,这是符合机制阐明在哺乳动物细胞[36-40]。我们还利用转基因飞模型进一步描述最近报道分子CA1 ALS患者的水平变化,发现CA1可以在飞运动神经元诱导ER应激反应。最重要的是,CA1可以抵消SOD1-linked ALS病理学在成年苍蝇在头两周内表明潜在的相声和时间敏感信号通路之间的相互作用引起的明显不同的有毒蛋白质可以受益细胞或生物体根据性质和动力学相关的细胞通路。这些信息是重要的,可能有助于发现药物治疗的发展。

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我们感谢疯王博士请提供爬行的成像系统测试。我们感谢王教授μ的阅读并提供关键的评论手稿。本人声明这段工作部分或全部由中国国家自然科学基金资助与格兰特号码:81071010;西安Jiaotong-Liverpool大学与格兰特数字:RDF-10-02-02 RDF-14-01-21。

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