羧酸酯和酰胺HLDF-6肽形式的比较研究:神经保护和益智药在缺血性中风动物模型的影响

目的:工作执行的比较研究两个药物的神经保护和益智药活动物质,HLDF-6肽及其酰胺(HLDF-6-NH形式₂)。

材料与方法:我们研究中使用健康成年雄性Wistar鼠年龄在180 - 200天重280 - 300克。我们模仿缺血性中风在大鼠颈动脉的慢性的阻塞。解决方案的HLDF-6-NH₂和HLDF-6肽鼻内接种。认知功能评估与小说对象识别测试和莫里斯迷宫。

结果:HLDF-6肽的氨基化合物形式更有效:HLDF-6-NH的神经活动₂,改善认知功能评估的动物,超过本机HLDF-6肽。一剂250 HLDF-6-NHµg /公斤₂肽导致几乎完全恢复干扰功能。缺血性中风模型中,酰胺的肽显著优于对照品mexidol有效剂量和生物活性。

结论:代理的研究结果让希望的成功进一步临床研究。针对高要求的代理和成功的临床试验,它必将成为广泛应用于临床实践,在治疗。

脑血管疾病是最紧急的医疗和社会问题的现代世界。神经系统疾病的患病率与循环不足20%的人口和向上趋势。许多神经系统疾病的特点是一个挥之不去的严重,持续的功能缺陷导致有限的或全部残疾[1]。最严重的脑血管疾病之一是缺血性中风(是)。机制性脑缺血脑组织损伤发展条件下的需要引进一种特殊类型的疗法被称为神经保护。神经保护旨在中断延迟机制的细胞death-oxidative压力、细胞因子失衡,局部炎症、营养障碍、细胞凋亡。之间的紧密互连所有神经组织死亡的机制激励开发的调制效应,可以通过刺激监管系统。肽是关键球员在监管过程[2]。最优的场景和其他大脑疾病治疗的同时应包括代理的应用影响疾病的发病机理中的几个关键组件。这些化合物的另一个重要需求是没有毒性的,当用于长期的预防治疗。 Due to their role as endogenous regulators, peptides can potentially exert multidirectional effects with low toxicity. In recent years, peptide agents have undergone extensive development due to the high selectivity of their effects in addition to theirminimal adverse effects, solubility in aqueous media, low toxicity, lack of immunogenicity, and low molecular weight [3]. Research on human leukaemia differentiation factor (HLDF), which we were the first to discover and isolate [4], revealed a hexapeptide fragment, Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg (HLDF-6), that reproduced the differentiating effects of the full-size factor. Direct evidence of the neuroprotective effects of HLDF-6 were obtained from experiments in a primary culture of neuronal cells from the hippocampus and cerebellum as well as in immunocompetent cells [5-8].

在实验模型的临床pathologies-Alzheimer病(AD)和样貌肽证明缓解明显认知不足,促进记忆检索。证明(9、10)的组织学研究实验动物的大脑切片,海马神经元的受损区域减少了几乎三倍于肌内注射的肽。此外,HLDF-6没有修改血流动力学指标,也没有破坏运动活动或运动协调的动物[11]。表明HLDF-6肽对动物管理和提供了一个可靠的慢性脑缺血神经保护作用,防止大脑神经元缺血性条件下死亡。在2012年- 2014年,我们进行了全面的临床前研究的一个高度有效的创新治疗代理基于HLDF-6益智药和神经保护作用。本研究的目的是开发一个药物预防和治疗神经退行性(广告)和脑血管疾病(是)。在两种形式的HLDF-6的药物动力学研究,即。本机肽(HLDF-6-OH)及其酰胺(HLDF-6-NH₂),我们发现HLDF-6-NH₂(H-TGENHR-NH₂在血浆)具有高水解能力。HLDF-6-NH的半衰期₂等离子体是8分钟,高于实际价值的几倍的羧基形成肽(H-TGENHR-OH)(2分钟)[12]。因此,在临床试验的过程中,我们进行了大量的对比研究两种药物的神经保护和益智药活动物质(PS) -HLDF-6-OH HLDF-6-NH₂——找到HLDF-6肽的最有效的形式。调查了在动物模型的广告,[12]。报告结果的比较研究神经保护和HLDF-6-OH和HLDF-6-NH益智药活动₂在动物模型的广告。在这项研究中,我们描述的类似调查结果缺血性中风的动物模型(是)——慢性闭塞carotid-2-VO)我们关注认知功能的研究来确定最有效的形式和剂量的药物,以进一步研究其作用的机制和可能的治疗潜力。

合成HLDF-6-OH HLDF-6-NH₂肽

合成两个制药HLDF-6-OH和HLDF-6-NH基础上的物质₂肽是另一篇论文中描述[12]。

实验动物

180 - 200岁的健康成年雄性Wistar鼠天体重280 - 300 g被用于这项研究。动物被安置根据当前的卫生规则安排,设备,和维护实验生物学诊所。标准实验室饮食与当前的规范是相一致的。动物们保持一分之四笼的条件下免费的水和食物在21°C常数14小时的一天(早上8点的灯打开)。环境因素(温度、湿度、照明和床上用品组成)会见了实验动物保健和使用要求。控制和实验动物保持在同样的条件下。执行的研究是根据俄罗斯联邦实验室实践的规则,建议的指导药物临床前研究物质[13]和经合组织国际食品及药物管理局GLP要求按规则使用特定无菌(SPF)实验动物(实验biomodels)。动物在动物育种生产设施(分支Shemyakin Ovchinnikov有机化学研究所、俄罗斯科学院Pushchino,莫斯科,俄罗斯)。设备已经全部AAALAC(评估和认证实验动物保健协会国际)认证。设施的质量管理体系认证根据国际ISO 9001:2008标准的要求。 All procedures were performed according to approved protocols. Each procedure involving animal treatment was reviewed and approved by the Committee on Humane Animal Treatment prior to the experiment.

造型在大鼠颈动脉慢性闭塞,2 VO模型

双边结扎手术(阻塞)的颈动脉进行全身麻醉下(Zoletil 15毫克/公斤+腹腔内甲苯噻嗪2µg /公斤)。在手术期间,我们固定动物抑制椅,一个纵向切口的锋面的脖子。借助钳子和玻璃钩子,颈动脉是分离迷走神经丝缝合和结扎。假的动物,丝绸缝合当时没有[14]建议的阻塞动脉。老鼠被分为9组(每组10动物)如下:组1,sham-operated动物;组2(控制),动物,与生理盐水治疗鼻内;治疗组3 - 5,动物与HLDF-6-NH鼻内₂剂量的250µg /公斤、50µg /公斤,和10µg /公斤,分别;治疗组6 - 8,动物与HLDF-6-OH鼻内剂量的250µg /公斤,50µg /公斤,和10µg /公斤,分别;9组,动物腹腔内注射药物的引用,mexidol,剂量为200毫克/公斤。总的来说,我们的96种动物,死亡率是6.04%(6大鼠)。两只动物死于对照组;1动物,在6组(HLDF-6-OH剂量的250µg /公斤);2、7组(HLDF-6-OH剂量50µg /公斤),和1组8 (HLDF-6-OH剂量的10µg /公斤)。所有死亡发生在手术后2-24 h。

协议肽认知功能的评估和管理

HLDF-6-NH₂和HLDF-6-OH肽的解决方案在一卷鼻内接种48µL /公斤分为两个鼻孔。mexidol,参考药物的剂量服用200毫克/公斤腹腔内1毫升/公斤盐。政府进行1和手术后24小时,以及天3、5、7手术后。认知功能评估使用小说对象识别后14 - 16天手术和莫里斯迷宫test18-22天后手术。11.00和15.00之间的所有行为进行了测试。

小说对象识别测试

小说进行对象识别测试房间照明在45×45×40厘米灰色塑料箱。每隔24小时测试包括三个5分钟会议如下:1,没有对象,适应的设置;2,有两个相同的objects-metallic圆柱体直径6厘米,8厘米高;和3缸取代塑料立方体6厘米边缘。动物行为与数码相机记录和分析使用EthoVision XT (Noldus)软件。识别指数计算公式(Tn-Tf / Tn + Tf)×100%, Tn新对象调查的时间,和Tf的时间熟悉对象调查实验的第三次会议依照[15]。

莫里斯迷宫

莫里斯迷宫实验中执行一个灰色圆形池直径165厘米,60厘米高墙装满水的深度40厘米。一轮树脂玻璃平台,直径9厘米,被放置在中心的一个部门,2厘米水位以下。池被关在一个房间里有许多环境刺激(站、日历、抽屉等),实验上的位置是常数。平台上面的关键刺激缺席。在培训期间,动物被放置在水在四个不同的点,和时间达到测量平台。一旦平台了,动物被留在了15秒,然后回到家里笼2分钟。训练了4天。一天训练后执行测试会话(研究形成稳定的空间记忆)。在会话期间动物放入迷宫没有平台的时间呆在“目标”象限,即。,在该行业平台之前,60年代的估计。

数据分析

统计处理结果进行使用下面的非参数方法:克鲁斯卡尔-沃利斯标准,中值测试和Mann-Whitney-Wilcoxon参数。STATISTICA 6.0 (StatSoft公司塔尔萨,美国)使用软件包。

小说对象识别测试

分析调查对象的时间每采集试验(表1)并没有透露任何有统计学意义的差异组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验:H (N = 98) = 3.88222, p = 0.1084)。因此,所有的治疗影响运动或取向和探索性活动。同时,统计重要的差异(克鲁斯卡尔-沃利斯检验:H (N = 100) = 28.84068, p = 0.0007)之间的组对象识别指数显示,描述声明性与边缘皮层功能相关的长期记忆(见对象识别指数在表1行)。比较个人的团体使用Mann-Whitney测试显示相当大的减少索引相比sham-operated动物的控制。物质的同时,政府正在研究导致该指数显著增加对控制的水平值sham-operated集团除了HLDF-6-NH₂肽的剂量50µg /公斤,每公斤10µg和HLDF-6-OH肽剂量的药物mexidol 10µg /公斤和参考。然而,在这些群体识别指数高于对照实验。这些数据表明HLDF-6-NH一个u型的剂量反应曲线₂肽在这个模型中,证明了在广告模式[12]。

长期在莫里斯迷宫空间的记忆

长期的主要特征空间的记忆在这个模型是时间到达平台的第一次尝试在每个训练的日子。分析并没有透露任何有统计学意义的差异通过这个值在第一组(克鲁斯卡尔-沃利斯检验:H (N = 100) = 11.67372, p = 0.2323)或第二(克鲁斯卡尔-沃利斯检验:H (N = 100) = 13.90251, p = 0.1258)培训一天。同时,统计上显著的组间差异显示在训练的日子里3(克鲁斯卡尔-沃利斯检验:H (N = 100) = 17.39247, p = 0.0429)和4(克鲁斯卡尔-沃利斯检验:H (N = 100) = 24.35808, p = 0.0038)。分析使用Mann-Whitney测试显示显著增加时间到达平台培训天3和4在控制老鼠的值相比sham-operated老鼠,这表明长期空间记忆的干扰由于颈动脉闭塞(表2)。

的HLDF-6-NH₂肽剂量的250µg /公斤恢复长期记忆的特点,在训练的日子里3和4的水平值sham-operated组;然而,这种肽的作用剂量的50和10µg观察/公斤只在第四天,非常温和。的刺激效应HLDF-6-OH肽在长期记忆的形成变得明显只在剂量的250µg /公斤和50µg /公斤;观察这种效应只有4天的实验和比HLDF-6-NH的影响较弱₂肽。HLDF-6-OH肽剂量的10µg /公斤不是有效的。参考药物mexidol不是有效的3或4天的实验。也观察到显著的组间差异指数稳定的空间记忆形成,即。,the time of stay in the target quadrant during the test without the platform (Kruskal–Wallis test: H (9, N=100)=29.61716, p=0.0005) (Figure 1). A comparison of the individual groups revealed that the HLDF-6-NH₂肽剂量的250µg /公斤增强空间记忆的稳定性不仅与对照组的值也与价值在sham-operated动物。剂量的50和10µg /公斤也有效,增强稳定性的空间记忆sham-operated老鼠的水平。HLDF-6-OH肽剂量的250和50µg /公斤是有效的,但比theHLDF-6-NH效率相当低₂肽,剂量的10µg /公斤,HLDF-6-OH肽的影响是低级的。该集团接收mexidol类似于控制。

脑血管障碍是全世界死亡和残疾的主要原因。识别有效的神经保护和益智药剂预防失忆在这些条件下的发展是现代科学最紧迫的任务之一。Neuroprotectors隐含促进/支持根除的神经毒性化合物(谷氨酸、自由基和跨膜钙)从受损的大脑区域,改善神经元的代谢,稳定神经元膜电荷。当前的不足影响神经保护药物被认为起源于这样一个事实:他们只为了保护神经元。然而,中风不仅仅是一个神经元损伤的过程;整个大脑疾病,包括中断正常的功能和关系的链接。这就是为什么人们寻求更高效的neuroprotectors,可以影响大脑的各种结构与主要的治疗方法正在进行。早些时候,HLDF-6-OH肽的神经保护效应(酸性形式)条件下的组织缺氧的小脑浦肯野细胞直接应用组织体内的条件下脑灌注不足(双边颈总动脉的闭塞,叫做船舶阻塞,或2-VO模型)在腹腔内政府(7、16)。2-VO模型中,显示的酸形式HLDF6不仅减轻记忆障碍,但也显著增加N-acetylaspartate和N-acetylaspartate /肌酸比值在缺血性动物[11]。在这里,我们比较两个药物的神经保护和益智药活动物质,HLDF-6肽(HLDF-6-OH)及其酰胺形式,HLDF-6-NH₂在动物模型,经鼻内政府脑血管病理,缺血性中风(颈动脉慢性闭塞,2-VO模型)。评估认知功能在动物中,使用了两个测试:这部小说对象识别测试,允许评估声明的长期记忆,和莫里斯迷宫,允许评估长期空间的记忆。

比较分析获得的数据表明,HLDF-6-NH的神经活动₂是模型,评估改善认知功能的动物,超过本机HLDF-6-OH肽。类似的数据是通过[12]在动物模型的广告。之间的差异研究医药物质的长期效果尤为突出空间的记忆在莫里斯的迷宫和BA模型。与参考neuroprotector代理相比,HLDF-6酰胺在有效剂量参数和生物活性表现更好。肽保护大鼠颈动脉闭塞后比mexidol更有效率,在中风治疗药物常用剂量的800倍低于mexidol。此外,相比之下mexidol,损害肝脏和肾脏,HLDF-6不是有毒的酰胺形式基于获得的数据在临床前研究[17]。综上所述,获得的数据允许HLDF-6-NH的结论₂肽细胞依靠有效的认知功能受损在所有模型在研究中,都是和广告。一剂250µg /公斤导致几乎完全恢复功能(统计上的显著差异而sham-operated控制和没有区别动物或超过后者值)。值得注意的是,在某些情况下,动物收到HLDF-6-NH₂肽剂量250µg /公斤甚至超过sham-operated动物的价值。因此,空间记忆的效率的实验动物模型是超过sham-operated动物的对应值40%。因此,一个剂量的HLDF-6-NH 250µg /公斤₂肽被选为主题进行进一步的临床前和临床研究和建立了作为一个有效的治疗剂量。

HLDF-6肽是天然人类白血病分化因子的片段(HLDF)出现在哺乳动物和人类的血液和中枢神经系统。HLDF-6-NH的临床前研究₂肽表明治疗代理基于物质是可溶性和容易代谢;它的展品没有免疫原性,特点是效率高。最后,它不是有毒的和安全的剂量相当于10倍治疗剂量对人类[17]。临床前研究的结果与该代理提供一个积极的前景进一步临床研究。代理的高需求,如果临床试验是成功的,它必将成为广泛应用于临床治疗和广告。我们开发了一个基于HLDF-6肽药物,属于一个新类的药物,即。肽neuroprotectors。我们是第一个发现HLDF蛋白质和HLDF-6肽和仍然是唯一一组使用这些化合物。这些都是原始的结果和同类中的第一个。目前没有使用肽链型药物与HLDF-6肽结构同源性。药用物质的优点基于HLDF-6酰胺在其他现有药物包括以下:创意,独特的治疗效果的表现,高水平和广泛的结合益智药和neuroprotector活动(有效的治疗都是和广告),效率低和超低剂量高,没有不利影响的情况下,没有毒性,和高效的管理路线(鼻内的政府)。

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