影响评价IL-6.C-572G基因多态性与血小板抗体阳性的临床因素

背景:白细胞介素- 6 (IL-6.)促进抗体产生。本研究的目的是调查是否IL-6.C-572G单核苷酸多态性（SNP）和临床因素与阳性血小板抗体试验有关。

材料与方法:随机选择30例血小板抗体阳性者(应答者)和20例血小板抗体阳性者(无应答者)。启动子区-572 C>G (rs 1800796)单核苷酸多态性IL-6.采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法进行基因分型。采用固相红细胞粘附试验(SPRCA)检测血小板抗体。

结果:年龄，性，良性疾病患者，患有纯合蛋白的患者的百分比 - 在-572左右IL-6.有反应者和无反应者的基因相似。血液病患者的血小板量高于非血液病患者(47.2±54.2)vs。17.4±13.8单位，p= 0.019)，血液病患者血小板抗体检出率低于非血液病患者(42.3%)vs。79.2％，p= 0.01)。

结论:两者之间没有联系IL-6.血小板受体固相抗体检测C-572G基因多态性及阳性反应性

在输血或怀孕期间暴露于非自身抗原后，可能会发生对人类白细胞抗原(HLAs)和人类血小板抗原(hpa)的同种异体免疫。同种异体血小板免疫是导致血小板难治性状态的几个因素之一。对同种异体免疫预测因子的了解可能有助于预防和管理血小板难治性。

Rh抗原不存在于血小板表面。然而，血小板浓缩物可能含有足够的红细胞(rbc)，以引起抗d抗体(抗d)反应。Cid等人发现，血液病患者在使用buffy coat法制备的血小板浓缩物输注D不相容血小板后，D同种异体免疫的风险很低。

白细胞介素- 6 (IL-6.)是由多种不同类型的细胞产生的，包括单核细胞、淋巴细胞、间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、角化细胞、系膜细胞和子宫内膜细胞[2,3]。IL-6.参与调节B细胞分化为产生抗体(Ab)的浆细胞和产生免疫球蛋白[4]。IL-6.通过促进CD4的B细胞辅助功能来促进抗体的产生⁺通过增加IL-21产生T细胞。IL-6.因此，[5]可能是一种增强体液免疫的潜在辅助剂。IL-6.抑制TGF-β诱导的调节T (Tregs)分化[6]。treg细胞在抑制免疫应答、维持免疫稳态中起着重要作用。在产生同种异体抗体(应答者)[8]的输血小鼠中观察到Treg活性降低。

IL-6.基因位于7p21，全长5kb。IL-6.在启动子区域C- 572g突变是胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代IL-6.基因被发现与肾移植[9]后供者特异性HLA抗体产生的增加有关。-174C等位基因IL-6.据报道，启动子地区与全身发作的幼年特发性关节炎有关[10]，以及欧洲类人的类风湿性关节炎的易感性[11]。IL-6.-174C等位基因在中国人口中很少见[12,13]。潘等人。研究了232个个体，发现231载有野生型-174g / g;只有1次携带GC基因型，并且根本未检测到CC基因型[12]。我们以前研究了149名个人，发现所有个人都有-174职位的GGIL-6.基因没有任何多样性[13]。但是还没有发表的研究检验了两者之间的联系IL-6.C-572G SNP与血小板抗体产生。

研究对象

健康受试者和患者总数为100例:健康受试者50例，有血小板抗体(应答者)30例，无血小板抗体(应答者)20例。

在30例应答者中，有11例(36.7%)患者伴有血液病(免疫性血小板减少症)n= 7，障碍性贫血n= 1，急性白血病n= 3)， 19例非血液病(感染性休克)n= 4，肝硬化n= 4,尿毒症n= 1,肺炎n= 1，乳腺癌n= 2，卵巢癌n= 1，肺癌n= 1,肝癌n= 2，前列腺癌n= 1，膀胱癌n= 1，肾癌n= 1)。

在20例无反应患者中，15例(75%)有血液病(免疫性血小板减少性紫癜)n= 1，再生障碍性贫血n= 3，骨髓增生异常综合征n= 2,急性白血病n= 4、淋巴瘤n= 4，多发性骨髓瘤n= 1)， 5例为非血液病(乙型肝炎n= 1,关节炎n= 1,肝癌n= 1，肺癌n= 1，卵巢癌n= 1)。

50名健康受试者(21名女性和29名男性;年龄中位数:32.5岁，范围:20-58岁)，无任何活跃性健康问题，常规体检实验室检查结果无肝肾功能异常迹象。

在血小板抗体检测前计算应答者的血小板累积量。血液病或恶性肿瘤患者输血的血液成分是白化的，而非血液病或非恶性肿瘤患者输血的血液成分是无白化的，这符合台湾白化成分补偿的规定。

本研究方案经台北退伍军人总医院机构评审委员会批准。所有受试者均提供书面知情同意。

血小板抗体测定

采用采用MASPAT试剂盒(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)的固相红细胞粘附试验技术检测患者血清中的抗血小板抗体(抗HLA I类和hpa)。阳性或弱阳性反应表明血清中存在血小板和/或HLA特异性抗体。

基因组DNA提取及基因分型IL-6.

用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System, Minneapolis, MN, USA)从血样中提取基因组DNA。启动子区-572 C>G (rs 1800796)单核苷酸多态性IL-6.如前所述，采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法对基因进行分型[13,14]。

统计数据

采用卡方检验拟合优度，检验偏离Hardy-Weinberg平衡的偏差。组间分类变量比较采用Pearson卡方检验和Fisher精确检验。Mann-Whitney U检验用于组间数值变量的比较。组间的差异被认为是显著的，如果p- 双尾的值小于0.05。使用IBM SPSS统计数据，版本20（IBM Corp. Armonk，Ny，USA）进行统计分析。

病人的特点

响应者恶性疾病的患者的年龄，性和百分比与非响应者的患者相似。患者血液学疾病患者的百分比低于非反应者（36.7％）vs。75%,p= 0.01，表1）。

在应答者中恶性肿瘤和血液系统恶性肿瘤的百分比

在30名应答者中，有12名患者(40%)患有恶性疾病(血液系统恶性肿瘤)n= 3，非血液病恶性肿瘤n= 9).在20例无应答者中，12例(60%)有恶性疾病(血液系统恶性肿瘤)n= 9，非血液病恶性肿瘤n= 3)。有反应的患者中恶性肿瘤患者的百分比与无反应的患者相似(40%)vs。60%,p= 0.248)，表1。

有应答者中血液学恶性肿瘤与非血液学恶性肿瘤的比率低于无应答者(1:3)vs。3:1,p= 0.039)。

-572C /G单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率IL-6.基因

基因型的分布IL-6.-572C> G（RS1800796）多态性与患者或雌性志愿者的Hardy-Weinberg比例没有不同。基因型的频率和等位基因IL-6.-572 C>G多态性在患者和健康受试者之间相似(表1)。

之间的联系IL-6.-572 SNP和血小板抗体生产

如表1所示，G等位基因的频率为-572IL-6.应答者与无应答者基因SNP相似(26.7% (16/60))vs。22.5% (9/40),p= 0.637)。

在响应者组中，具有G阳性（CG + GG）基因型的接受者的百分比与非响应者组的百分比相同（40％）vs。40%,p= 1.0）（表1）。

年龄、性别、良性疾病患者百分比、血液病患者百分比和血小板输注量在CC基因型和g阳性基因型(-572)之间没有差异IL-6.基因促进者（表2）。

与CC基因型患者相比，g阳性基因型患者产生血小板抗体的相对风险为-572IL-6.基因启动子SNP为1.0 (95% CI: 0.63-1.587)。在-572之间没有观察到关联IL-6.g阳性基因型和血小板抗体的产生。

血液病与血小板抗体产生的关系

恶性疾病患者的年龄、性别百分比、G阳性基因型患者在-572位的百分比等基线特征无显著差异IL-6.基因在血液学组和非血液学组之间被注意到，表3。血液病患者输血血小板计数高于非血液病患者(47.2±54.2)vs。17.4±13.8,p= 0.019）（表3），但血液学疾病患者的血小板抗体的检测率低于非血液学疾病的患者（42.3％）vs。79.2％，p= 0.01)(表1)。与血液病患者相比，非血液病患者产生血小板抗体的相对风险为1.871倍(95% CI: 1.142 - 3.065)。

我们的数据发现，有应答者(产生血小板抗体)的血液病患者的百分比低于无应答者。而患者的年龄，女性，以及IL-6.C-572G基因多态性不是血小板受体产生血小板抗体的危险因素。在我们的研究中，健康对照组受试者的年龄小于患者(有反应者和无反应者)，但有反应者和无反应者的年龄相似(p= 0.804)。因此，年龄对血小板抗体产生的数据分析没有影响。

没有妊娠或输血历史的供体中，HLA类抗体的患病率为2.27％（2/88）[15]。Schnaidt等人。在怀孕后测试了500种雌性血液供体的血清，使用血小板抗原（Maipa）测定的单克隆抗体固定化血小板特异性抗体（HPA-1,3,5）。发现二十一条血清（4.2％）为阳性：四种抗HPA-1A，一种抗HPA-5A和16抗HPA-5B。在最后一次怀孕后血清阳性至30年[16]。Koerner及其同事分析了血清抗体对血小板特异性糖磷脂（GSL），仅在免疫血小板减少紫癜（ITP）患者的血清中检测到该抗体。他们发现一半（6/12）患者的ITP患有与血小板特异性GSL结合的抗体。来自10名非免疫血小板减少症患者的血清，并且18个正常受试者中只有1个患者与血小板特异性GSL组进行阳性反应[17]。

细胞因子是对抗外来抗原免疫反应的重要调节因子。对外源抗原的反应主要由CD4调节⁺辅助t细胞(Th)，根据其产生的细胞因子可细分为不同的亚群Th1和Th2。Th2亚群帮助B细胞增殖和分化，并与体液型免疫反应有关。IL-6.促进Th2分化[18]。IL-6.在炎症反应和抗体生产中发挥重要作用[19]。IL-6.发现有抑制早期Friend病毒复制[20]的功能。我们之前已经发现IL-6.C-572G基因多态性与抗e抗体(anti-E)的产生显著相关，等位基因G为风险等位基因[13]。

Friedman等人发现输血镰状细胞病(SCD)患者对红细胞(30%)和血小板(85%)的同种异体免疫率都很高，但没有发现红细胞和同种异体血小板免疫之间的显著相关性。这表明对红细胞抗原有反应的人不太可能对与同种异体血小板免疫有关的抗原决定因子[21]有反应。Verduin等人的研究表明，镰状细胞病女性发生同种异体红细胞免疫的相对风险(27.0%)高于男性。在无血红蛋白病的患者中，男性和女性异体红细胞免疫的风险似乎相似[22]。这可能是因为患有镰状细胞病的女性在怀孕和/或输血过程中暴露于免疫事件的更多。在我们的研究中，与男性相比，女性患者血小板同种异体抗体的相对风险往往增加(53.3%)vs。30%,p= 0.103）。Sharpe等人。发现HLA-AlloImmunization率根据性别不同：22％适用于男性（4/18）vs。女性67％（10/15）[23]。

在本研究中，血液学患者的总血小板需要量高于非血液学患者。这可能是由于血液学患者经常出现血小板减少，这是潜在疾病本身和治疗的结果，血小板减少患者需要输血来预防或治疗血小板减少的出血表现。王等人发现anti-HLA和anti-HPA同种抗体被发现在114年204例(55.88%)患者血小板耐火度,其中包括110名(96.49%)与anti-HLA同种抗体,2例(1.75%),anti-HPA同种抗体只和2(1.75%)与anti-HLA和anti-HPA同种抗体(anti-HPA-3a和anti-HPA-5b)[24]。Kiefel等研究了252例血液病或肿瘤病患者的血清样本，其中113例(占252例的44.8%)血清中检测到了血小板抗体[25]。本研究中血液病患者血小板抗体检出率为42.3%，低于非血液病患者血小板抗体检出率(79.2%，p= 0.01)。

血小板表达HLA I类抗原，但血小板不表达HLA II类抗原[26]。原发性HLA同种异体免疫依赖于识别HLA I类和II类抗原的差异。含有II类抗原(如淋巴细胞和抗原提呈细胞)的活细胞的存在对于刺激原代HLA同种异体免疫是必要的。如果找到了从物理上移除携带ii类白细胞或使其失活的方法，HLA同种异体免疫就可以被预防。然而，这种方法不能阻止血小板特异性同种异体抗体的形成，这是由于输血不相容的血小板抗原[27]。

在一项荟萃分析中，Vamvakas结合了8项随机对照试验的结果，发现在预防hla同种异体免疫[28]中，白细胞减少具有统计学意义的益处。Seftel等报道，在多次输血的患者、接受干细胞移植的患者以及接受积极化疗[29]的急性白血病患者中，普遍的预储存白细胞减少降低了同种异体血小板免疫。在我们的研究中，血液病患者的血液成分是白细胞减少的，与非血液病患者相比，血液病患者的同种异体免疫率较低可能是白细胞减少的原因。

[21]。提示，与免疫功能低下的癌症和BMT患者相比，在预防同种异体血小板免疫方面，白血球减少对免疫活性SCD患者的效果可能更差。强化化疗可能抑制抗体的产生。Schonewille等人发现接受强化化疗的患者形成抗体的比例比其他患者低得多[30]。Reinhardt等发现，恶性肿瘤儿童的强化化疗会导致部分免疫缺陷，包括体液免疫[31]的长期损害。Asfour等人发现，对于接受了RhD阴性骨髓和/或外周血干细胞的血液学癌症患者，将RhD阳性血液成分输血给他们，其产生RhD抗体[32]的风险很低。Schonewille等人研究了血液病和肿瘤病患者输血后的同种异体免疫，发现接受强化化疗的患者形成抗体的比例远低于其他患者[30]。Arora等人发现，实体癌(22.6%)或骨髓增生异常综合征(23%)患者的同种异体免疫率高于其他血液系统恶性肿瘤(7%)患者。血液病患者的化疗强度高于非血液病患者。在我们的研究中，有反应和无反应的恶性肿瘤患者的百分比相似(40%)vs。60%,p= 0.248），但血液学恶性肿瘤与非血液性恶性肿瘤的比率比非反应者患者较低（1：3vs。3:1,p= 0.039)。因为输血给血液病和恶性疾病患者的血液成分是白细胞减少的，所以我们可以假设高强度的化疗可能比白细胞减少更有助于减少血小板抗体的形成。

总之，我们的发现表明两者之间没有关联IL-6.血小板受体固相抗体检测C-572G基因多态性及阳性反应性在降低血小板抗体形成方面，高强度的化疗可能比降低白细胞更有效。

作者感谢台北退伍军人总医院全体员工对本研究的支持。本研究由台北退伍军人总医院医学研究基金资助(V106C-179)。

作者贡献

所有的作者都对研究的概念和设计做出了贡献。

林正时分析和解释了资料，并撰写和修改了手稿。

李立轩设计了这项研究，进行了实验，并审阅了手稿。

刘香梅设计了这项研究，进行了实验，并审阅了手稿。

陈陈陈制备了所有试剂和仪器，并审查了手稿。

赵曾杰审定了原稿。

1. 引用本文:王志强，王志强，王志强，等。血液学患者输d不相容血小板后缺乏抗d同种异体免疫。输血。2002;42: 173 - 176。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11896331/
2. 白介素6的生物学和临床意义。今天Immunol。1990;11: 443 - 449。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2127356/
3. 白介素-6在生物医学中的应用。难以Immunol。1993;54: 1 - 78。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8379461/
4. Rieckmann P, D'Alessandro F, Nordan RP, Fauci AS, Kehrl JH。IL-6.和肿瘤坏死因子。自分泌和旁分泌细胞因子参与B细胞功能。J Immunol。1991;146: 3462 - 3568。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2026875/
5. 王志强，王志强，王志强，等。抗体产生的诱导IL-6.是由CD4⁺T细胞。J Exp Med. 2009;206: 69 - 78。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19139170/
6. 陈志强，陈志强，陈志强，等。产生致病效应TH17和调节性T细胞的相互发展途径。大自然。2006;441: 235 - 238。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16648838/
7. 调节性T细胞的转录调控和发育。Exp Mol Med. 2018;50: e456。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29520112/
8. 鲍卫东，于建军，于建军，等。红细胞免疫应答和非应答小鼠调节性t细胞状态的研究。血。2009;113: 5624 - 5627。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19336757/
9. II类转激活因子和白细胞介素-6多态性对同种异体肾移植受者抗供体人白细胞抗原不匹配抗体产生的影响国际免疫遗传学杂志。2009;36: 235 - 239。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19523152/
10. Fishman D, Faulds G, Jeffery R, mohammad - ali V, Yudkin JS等。白细胞介素-6新多态性的影响(IL-6.)基因IL-6.转录和等离子IL-6.与系统性少年慢性关节炎的关系。J clinin Invest. 1998;102: 1369 - 1376。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9769329/
11. 白介素-6多态性与类风湿关节炎的相关性研究。Inflamm杂志2012;61: 665 - 671。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22427231/
12. 潘敏，高树平，姜明辉，郭军，郑建国，等。正常汉族人群白细胞介素6启动子多态性:频率和对炎症标志物的影响。J invest Med. 2011;59: 272 - 276。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21157373/
13. 林俊生，李丽华，刘慧敏，陈玉杰，邱天俊。协会IL-6.C-572G基因多态性与抗e产生。Transfus Med Hemother. 2018;45 - 52。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29593460/
14. Mazzatti DJ, Malavolta M, White AJ, Costarelli L, Giacconi R等。白介素-6 -174C/G和金属硫蛋白1A +647A/C单核苷酸多态性对锌调控基因表达的影响Exp Gerontol。2008;43: 423 - 432。
15. Quillen K, Medrano C, Adams S, Peterson B, Hackett J，等。在两个高通量平台上筛选血小板采集者的HLA抗体及其与受体结局的相关性。输血。2011;51: 504 - 510。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20849407/
16. 女性献血者妊娠后血小板特异性抗体的研究。Transfus医学。2000;10: 77 - 80。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10760206/
17. Koerner Ta，Weinfeld HM，Bullard LS，Williams LC。抗血小板磷脂的抗体：通过定量HPTLC-Autoradoography和与自身免疫和同种势过程的关联检测血清中的检测。血。1989;74：274-284。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2752115/
18. 常数SL，底部K. Th1和Th2 CD4的诱导⁺T细胞反应:替代方法。免疫年度Rev . 1997;15: 297 - 322。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9143690/
19. 白介素-6的生物学。血。1989;74: 1 - 10。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2473791/
20. Strestik Bd，Olbrich Ar，Hasenkrug KJ，Dittmer U. IL-5的作用，IL-6.IL-10在对Friend逆转录病毒(小鼠白血病病毒)感染的初级和疫苗引发的免疫反应中的作用。J Gen Virol. 2001;82: 1349 - 1354。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11369878/
21. 弗里德曼DF，Lukas MB，Jawad A，Larson PJ，Ohene-Frempong K，等。镰状细胞病患患者的异药到血小板。血液。1996年;88：3216-3222。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8874223/
22. Verduin EP, Brand A, Schonewille H.女性是输血后同种红细胞免疫的危险因素吗?系统回顾。Transfus Med 2012年修订版;26日:342 - 353。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22244869/
23. Sharpe CJ, Liwski RS, Couban S, Sadek I, Kahwash EB。HLA-和hpa -同种异体免疫率在血小板输注难治性的情况下:一项单中心研究血。2011;118: 3366。
24. 王军，夏伟，邓军，徐旭，邵勇，等。血小板反应性同种异体抗体分析和交叉配型血小板治疗难产患者的评价。Transfus医学。2018;28: 40-46。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28516675/
25. 输血患者血小板同种异体抗体的研究。输血。2001;41: 766 - 7670。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11399817/
26. 血小板上HLA I类表达的降低:处理HLA异体免疫难治性患者的一种潜在方法。Transfus医学1999年修订版;13: 95 - 105。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10218233/
27. 斯奈德EL。预防HLA同种异体免疫:白细胞耗尽和UV-B照射的作用。耶鲁大学医学杂志1990;63: 419 - 427。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2293501/
28. Vamvakas EC。减少白细胞预防同种异体hla免疫和随机供体血小板输注难治性的随机对照试验的meta分析Transfus Med, 1998年修订版;12: 258 - 270。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9798269/
29. Seftel MD，Growe GH，Petraszko T，Benny WB，Le A等人。加拿大的普遍普拉斯核算机降低了血小板同种异体和耐火性。血液。2004;103：333-339。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12958065/
30. Schonewille H, Haak HL, van Zijl AM。血液病和肿瘤病患者输血后同种异体免疫。输血。1999;39: 763 - 771。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10413286/
31. 传统化疗对儿童癌症治疗中疫苗可预防疾病抗体水平的影响。中华传染病杂志2003;35: 851 - 857。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14723361/
32. 在rhd阴性的骨髓移植受者中输血rhd不相容的血液成分。MedGenMed。2004;6: 22。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15520646/
33. 张志强，张志强，张志强，等。rhd不兼容红细胞输注后，癌症类型预测同种异体免疫。输血。2017;57: 952 - 928。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28191636/