非手术生育控制越来越提倡更具成本效益比手术消毒管理流浪动物种群在不同的世界的一部分。实验研究从2018年12月到2019年4月Mekelle大学评估的影响单双边intratesticular注入溴棕三甲铵2%成人白化病老鼠。总共20临床健康白化病老鼠选择根据他们的年龄和性别,并随机分为五组和评价进行了30天intratesticular注射后溴棕三甲铵溶液的剂量率5 2%,10年、15年和20毫克睾丸和控制0.1毫升生理盐水/睾丸每100克体重。所有白化小鼠进行评估以固定间隔30天。体重的变化,阴囊宽度、性行为和生殖性能也得到了评估。30天,所有白化小鼠以牺牲组织病理学研究。意味着±标准差的意思是,单向的,和一个混合模型方差分析(重复措施)被用来总结数据,确定组和时间对体重的影响和阴囊宽度。体重显著增加(p - 0.001)和阴囊宽度显著减少(p(0.001)被发现在所有溴棕三甲铵相比,对照组治疗。此外,有显著(p < 0.05)降低阴囊宽度白化小鼠溴棕三甲铵intratesticular注射后1天,10、15、20、25、30对他们的实验小组。睾丸组织学显示细精管有多核巨细胞,错乱的管状结构以及白细胞的浸润和纤维组织的出现被认为在睾丸部分15至20毫克的剂量率。 Similarly, a significant change in the sexual behavior of the treated males and no pregnancy was detected on female albino mice after 21 days post-coital at 10, 15, or 20 mg cetrimide-treated males. In conclusion, a single bilateral intratesticular injection of cetrimide 2% at a dose of 15 and 20 mg might provide an effective way of sterilization and may be considered as an alternative to surgical castration in male animals. Besides, further assessment should be done in the future to identify the mechanism of infertility.

阉割是最常见的手术之一,通常执行消毒动物不适合基因池并消除男性行为以及减少公害[1]。兽医仍实行开放的阉割手术方法是最有效和雄性动物绝育的惟一手段。然而,阉割的开放手术术后护理需要减少出血和感染的风险。此外,这种方法有一些缺点:不划算和耗时严重术后并发症的风险[2 - 4]。

与手术方法,挑战已经被不同的生殖生物学家开发化学杀菌方法,这可能是一个更好的替代手术阉割,以及适合大规模绝育的雄性家畜没有术后危险(2、5)。除此之外,在过去的几十年里,不同的化学药剂试图带来使用无机化学阉割,immunocontraceptives,和激素包括雄激素[6],孕激素[7],雄激素+ progestagens(8、9)受体激动剂和促性腺激素释放激素(GnRH) [10]。

不同的研究人员评估非手术注射灭菌的各种激素在许多种类的雄性动物,但这些疗法未能引起永久性不育。免疫技术也被用于诱导抗体促性腺激素和促,表明这样免疫技术在精子缺乏有效性和持续时间的不同。疫苗接种不良反应也观察到的另一个缺点(11、12)。

因此,几次在寻找有前途的有效的化学剂,其中包括intratesticular注射(它)的各种化学药剂来促进各种物种如恒河猴的阉割(铁的盐)[13],老鼠(洗必泰)[4、14],老鼠(高渗盐溶液和氯化钙)[15],犬(氯化钙、葡萄糖酸锌、乙醇、Eugenia caryophyllata精油和甘油)(5、12、19号),猫(氯化钙、葡萄糖酸锌)[26],牛(高渗氯化钠)[-],驴(氯化钙)[2],绵羊的(福尔马林)[30]和山羊的(氯化钙和葡萄糖酸氯和溴棕三甲铵)(31、32)。

化学消毒发现应用程序在某些种类的雄性动物,如猴子、山羊、公牛,仓鼠,兔子,狗(28、31)。因此,研究人员在过去的几年中也尝试了各种化学药剂如达那唑、丙三醇、乳酸、氯化铁、硫酸亚铁、氯化钙(氯化钙)Calmette-Gue´rin (BCG)、葡萄糖酸锌(Neutersol)和20%高渗盐水诱导的化学灭菌[33]。intratesticular后,然而,所有这些化学药剂注入已表现出疼痛,发热,甚至严重的睾丸炎睾丸炎。等代理、氯化镉、甘油、乳酸引起睾丸组织的选择性破坏[21日34]与[35]可逆睾丸组织损害。

尽管化学物质影响睾丸组织的破坏,它也并发症和一些缺点。例如,在某些情况下,间质部分细精管后重新生成一个初始阶段,睾丸萎缩,这导致了二次男性行为导致动物[36]的管理问题。由于这种类型的并发症引起的上述化学物质的使用,一个有效的chemosterilizing代理还没有定论。

同样,不同的研究仍在进行,研究人员一直在开发一种化学阉割的方法感兴趣,可能是一个更好的选择手术方法(33岁,37)。此外,手术方法不是有效的大规模应用,特别是对于控制人口规模庞大的不良哺乳动物在社区就像流浪狗。除此之外,术后护理和管理的动物也需要防止感染[31]。此外,切精管政策和臣属的阻塞比阉割微创手术,尽管如此,这些程序也进行类似的麻醉和手术后的并发症风险[2,3]。

理想的化学灭菌剂应该是永久性的,低成本的治疗,有效地逮捕精子发生和雄核发育,不影响动物的福利以及无副作用(4、5、33岁,38)。因此,当前的实验的目的是确定的有效剂量和评估疗效溴棕三甲铵2%注射双边在睾丸组织中诱导化学灭菌的白化大鼠睾丸组织学检查的基础上组织和基于男性的性欲和生殖性能白化病老鼠。

研究动物

20只成年雄性白化病老鼠瑞士应变,90天的年龄,一则通用之间的权衡,选择和安置四个白化病老鼠笼在环境温度(22±2 0 c)和湿度(60±5%)photoperiod-controlled房间(光/暗:十四10小时)免费食物和水随意标准实验室。老鼠被允许适应的实验室条件下保持15天前的实验。

国立卫生研究所,指导实验室动物保健和使用的[39]又在整个实验期间。实验协议还会见了动物保健和使用指南的科学研究[40]和所有程序当前的工作已批准的动物伦理委员会和实验(AEEC)兽医科学学院Mekelle大学。

实验设计

实验研究设计进行了从2018年12月到2019年4月使用临床健康男性白化小鼠评估的效果2%溴棕三甲铵后一个双边intratesticular注入。为了确定单个的功效intratesticular注入溴棕三甲铵化学灭菌,二十老鼠无菌处理分析级溴棕三甲铵(溴棕三甲铵;示巴制药、埃塞俄比亚的亚的斯亚贝巴)。

因此,所有的实验男性白化小鼠(n = 20)被分成五组。四个临床健康男性白化小鼠被完全随机分组每个实验组阻断技术基于体重和年龄[41]。组被随机分配到五个不同的组根据剂量溴棕三甲铵的含量。五组保存在一个单独的笼子在病理学实验室研究单位的兽医科学学院Mekelle大学。每个实验的体重和阴囊宽度记录收集的男性白化病老鼠实验的起始日期(预处理),直到实验结束后(30天后处理)。

溴棕三甲铵管理解决方案

所有实验白化病老鼠分配分成五组,被关在单独的笼子里。除此之外,所有的群体都在相似的环境条件下和提供相同的随意食物和水除了不同剂量治疗如下所列。

组1:四只老鼠他们每个人都被赋予了一项单一的双边intratesticular注入无菌生理盐水0.1毫升/每100克体重和睾丸被认为是作为对照组,平均体重44.43±2.45克之间的范围

组2:四只老鼠他们每个人都被赋予了一项单一的双边intratesticular注射的剂量溴棕三甲铵2% 5毫克/ 100克体重每睾丸平均重量45.48±2.28克之间的范围。

组3:四只老鼠他们每个人都被赋予了一项单一的双边intratesticular注射的剂量溴棕三甲铵2% 10毫克/ 100克体重每睾丸平均重量47.68±6.19克之间的范围。

第四组:四只老鼠他们每个人都被赋予了一项单一的双边intratesticular注入溴棕三甲铵2% 15毫克的剂量每100克体重每睾丸平均重量41.35±4.72克之间的范围。

组5:四只老鼠他们每个人都被赋予了一项单一的双边intratesticular注入溴棕三甲铵2% 20毫克的剂量每100克体重睾丸平均体重42.03±4.33克之间的范围。

intratesticular注入溴棕三甲铵技术解决方案

所有男性白化病老鼠控制下光背卧位乙醚麻醉和克制,阴囊彻底擦洗,用70%的乙醇清洗解决方案。Intratesticular注射认真执行。所有注射进行使用0.5毫升100单位胰岛素注射器32 g, 4毫米针,一个单独的针是用于每一个睾丸。

注射在颅管理区域的睾丸和针直接从每个睾丸的caudoventral方面大约0.5厘米的睾丸,附睾的尾巴向dorsocranial方面与针睾丸的长轴平行。仔细的解决方案是沉积在整个轴的睾丸线性渗透而退出针从近端到远端。也必须小心防止渗流解决方案的注射部位。

干预监测和临床观察白化病老鼠

所有的实验白化病老鼠在临床观察从天0(在实验前)30天。白化病老鼠的行为变化(态度),食物和水的消耗,总值阴囊宽度的变化,和行走能力评估日常直到实验结束后(从第一天到30天)。

同时,实验白化小鼠体重和阴囊宽度的测量和记录从第0天(治疗前),然后在白化小鼠的体重和阴囊宽度测量1天,5、10、15、20、25、30创意人恭谨有加。身体重量测量使用重量平衡,体重记录在克(gm)此外,阴囊睾丸大小的宽度被用作索引[42]。睾丸阴囊左右宽度的测量使用实验室卡钳和被记录在毫米(mm)。数据被表示为一个意味着宽度之间的左和右睾丸。

评估性行为和生育的性能

post-injection期30天,性行为和生殖性能的对照组和cetrimide-treated白化小鼠评估。因此,每个男性白化小鼠被允许与成熟,健康,肥沃,处女,和正常周期性(为期4天发情周期)女性白化病老鼠。每个男性白化病老鼠笼子里有三个雌性连续六天。性行为是观察和记录的控制男性白化病老鼠和cetrimide-treated男性白化病老鼠。此外,行为变化包括喧哗,生殖器嗅探、追逐,把握,越来越多,休息,吃饭,喝酒,和侵略也评估。交配的雌性都让单独关在笼子里,保持了21天,以检查他们的怀孕。

组织病理学研究睾丸

所有的白化病老鼠牺牲后30天内根据使用的协议(16、17)。光下的白化病老鼠牺牲乙醚麻醉从每个白化小鼠睾丸被和用于组织病理学研究。睾丸样本分块横向和检查严重。代表样本总损伤睾丸。睾丸样本每个白化病老鼠在10%中性缓冲福尔马林浸泡48小时后的膜白色的样品准备进一步自动化组织处理。

样品被削减,准备在1×1厘米大小,在梯度酒精脱水系列其次是嵌入在石蜡(熔点55-58 oC)。石蜡块准备和串行部分从每个睾丸被从中间部分的厚度5μm使用旋转切片机。这些部分是沾hematoxylin-eosin染色和挂载使用DPX mountant。睾丸组织的定性研究,包括细精管和细精管的组织学结构,孔隙空间,生殖细胞排列在每只动物的小管,然后进行幻灯片被光学显微镜检查[43]。组织病理学损伤睾丸的得分根据[44]。

数据管理和统计分析

收集的数据从实验室记录的格式为这个目的开发(附件一),后来进入Microsoft Excel 2016和分析进行了使用标准统计软件(占据版13)。数据使用描述性统计和总结所有的值被表示为意味着±标准差的意思。此外,单向方差分析是用来确定溴棕三甲铵的影响以及说明因变量之间的关系(白化小鼠的体重和睾丸宽度)和独立变量(溴棕三甲铵)。混合模型方差分析(重复措施)是用来确定组和时间的影响体重和阴囊宽度。被认为具有统计显著性差异p < 0.05。此外,组织病理学结果发现每组治疗的对照组记录以及他们的解释提出了与各自的团体和数字。

道德的考虑

道德许可和批准了在动物伦理和实验的实验工作委员会(AEEC)兽医科学学院Mekelle大学。

在本实验研究中,男性白化小鼠临床监测和评估实验后30天后intratesticular注入溴棕三甲铵2%剂量的5、10、15、20毫克/ 100克体重。因此,根据临床观察,治疗白化小鼠容忍溴棕三甲铵的intratesticular注射,没有遭受任何痛苦,标志着睾丸炎症肿胀。没有明显的不适表现出任何的老鼠,从乙醚麻醉后复苏注入或在实验过程中。

没有明显的变化在食品消费中五组动物在整个实验期间。所有的老鼠注射溴棕三甲铵在不同剂量显示发病率或死亡率的研究。后期检查每个治疗的动物已经表明,在附睾尾没有受伤,由于intratesticular注入这个代理。单一的影响双边intratesticular注入溴棕三甲铵2%体重,阴囊宽度,和白化小鼠的性行为评估为30天,所有的输出都是描述如下所示。

intratesticular注入溴棕三甲铵后对体重的影响

单双边intratesticular注入的影响溴棕三甲铵在体重剂量的5、10、15、20毫克/ 100克体重的白化小鼠的天跟进如图1所示。因此,在实验的最后(30天),有一个增加的体重(46.1±3.94)所有白化病老鼠溴棕三甲铵治疗组和对照组。因此,有一个显著增加(p - 0.0000)白化小鼠的体重在所有治疗组在整个实验后一个双边intratesticular注入溴棕三甲铵相比,对照组2%(图1)。

影响溴棕三甲铵的阴囊intratesticular注射后的宽度

单intratesticular注入的影响溴棕三甲铵在阴囊宽度白化小鼠剂量的5、10、15、20毫克/ 100克体重在天的跟进与对照组相比是如图2所示。30天,有一个减少的平均阴囊宽度(8.38±1.23)所有白化病老鼠溴棕三甲铵治疗组。因此,有一个显著减少(p(0.0000)的意思是阴囊宽度的白化小鼠不同剂量治疗的对照组相比(图2)。

溴棕三甲铵用于比较不同剂量对天的跟进

均值的比较溴棕三甲铵白化小鼠的体重和阴囊宽度在不同剂量的治疗对天的跟进表1和表2所示。因此,有显著(p - 0.04)增加的体重20 intratesticular注射后的溴棕三甲铵治疗组(表1)。

如表2所述,有一个显著减少阴囊宽度的白化小鼠在第一天(p (0.04), 10 (p (0.0001), 15 (p (0.0001), 20 (p (0.0000), 25 (p - 0.0000)和30 (p(0.0000)对每个实验小组。然而,没有明显减少阴囊宽度在白化小鼠(0)天intratesticular注入溴棕三甲铵在所有剂量的治疗(表2)。

睾丸组织的组织病理学影响

的睾丸组织进行组织病理学检查实验的最后人道牺牲后(30天)每一个白化病老鼠。因此,从每个实验白化小鼠睾丸采集标本从每组治疗的评估的影响溴棕三甲铵2%单双边intratesticular注入。常规组织病理学进行处理和染色的样品。睾丸部分和组织架构的定性评估细精管,小管间质细胞和生殖细胞排列的每个样本进行,在光学显微镜下。因此,不同组织病理学发现睾丸组织的记录。

组1的组织病理学结果显示细精管包括生殖细胞完整明确了工作和细胞结构。此外,不同级别的精细胞,滋养细胞、睾丸间质和间质细胞也完好无损。因此,睾丸部分显示正常安排细精管有明显的小空间的生殖细胞和间质细胞在对照组(图3)。

组织病理学发现组2表示,在一些intratubular细胞变性,部分地区的一些坏死区域的外观细精管。不成熟的生殖细胞的脱落,基底膜进入管腔内的空间。观察表皮脱落生殖细胞的小管。然而,没有增厚或间质炎症细胞和生殖细胞和细精管是正常的;然而,在一些细精管坏死,成为空(图4)。

根据组织病理学发现第三组,有显著的凝固性坏死和纤维化程度的细精管。间质血管空间是充血(拥挤),扩张,红细胞表面。除此之外,还有小间质增厚,擦到腔。在细精管,intratubular细胞退化,一些坏死和腐屑进入腔和小管几乎是空,严重坏死。然而,一些细精管,间质细胞包括睾丸间质细胞显示正常安排(图5)。

在4组,睾丸组织的组织病理学结果显示有严重的睾丸实质坏死和萎缩的细精管。此外,大多数的小管完全扭曲管之间由于没有具体的界定和额外的管状区域。在所有的小管,intratubular细胞包括塞尔托利氏细胞坏死和小管是空的。知名的变性和坏死,间质细胞和睾丸间质细胞的纤维化明显(图6)。

组织病理学发现团队5显示所有组织坏死,甚至很难确定在睾丸组织结构。除此之外,完全的管状结构错乱,没有任何明显的边界之间的管状和额外的管间的渗透整个睾丸组织大量白细胞。引人注目的外观的纤维组织整个睾丸生殖细胞也指出部分(图7)。

评估性行为和生育的性能

有剧烈的变化指出cetrimide-treated白化小鼠的性行为的控制相比,白化病老鼠。所有白化小鼠接受不同剂量溴棕三甲铵溶液和那些接受高剂量是15和20毫克溴棕三甲铵没有显示性欲与雌性交配。男性的生育表现进行评估通过观察女性的怀孕状况白化小鼠交配后21天单独关在一个笼子里。

21性爱后一天,四个女白化小鼠保持与男性白化小鼠服用不同剂量5、10、15、20毫克。因此,所有的男性白化病老鼠一直在五组(20毫克/ 100克体重)无法与那些co-caged交配雌性白化病老鼠和没有记录在这一组怀孕。然而,所有被允许与控制雄性交配的雌性怀孕率100% 21天性爱后(表3)。

Intratesticular注射化学物质的调查作为避孕的方法在不同的动物超过五年。然而,这个实验研究是第一个显示的有力影响溴棕三甲铵intratesticular注入后男性白化病老鼠和组织学变化。虽然手术阉割是最有效的方法,各种化学药剂的注入到附睾可以帮助限制男性生殖(3,18岁,45岁)和睾丸[46]。在目前的研究中,一个单一的intratesticular注射高剂量的溴棕三甲铵(15至20毫克)造成了严重的白化小鼠睾丸组织的坏死和变性。

一些系统性的管理路线如腹腔内、皮下、静脉注射和口服用于交付代理睾丸研究对精子发生的影响。intratesticular注入是一种技术,可以提供一些潜在的好处,在政府的其他路线,生育控制或调节的研究精子发生[2,22日,23日,25日,32岁的47]。该方法可用于研究的化学物质的直接影响睾丸等未知毒性和代理系统代谢。开发了各种化学消毒剂对注入白化小鼠的睾丸,这要么是安全而不是有效的,反之亦然(16、17、48)。

许多调查人员雇佣intratesticular注射研究各种制剂的化学灭菌效果[3,23岁,25岁,47]。罗素等人在1987年研究intratesticular注入技术,发现可以使用无菌26-gauge针,没有对细精管的组织学的影响。研究还表明生理盐水、乙二醇二甲亚砜(DMSO) 1:1混合盐水和丙二醇是合适的注入化学物质,因为他们并不影响睾丸组织学[3,49]。

在本实验研究中,溴棕三甲铵存在剂量依赖的相关性引起的化学杀菌的效果进行了评估单双边intratesticular注入溴棕三甲铵2%体重,阴囊宽度,白化小鼠的性行为。此外,组织病理学检查睾丸组织进行调查和评估睾丸组织的组织学改变。所有实验小鼠组临床监测30天。所有治疗白化小鼠容忍intratesticular注射溴棕三甲铵和没有明显不适,痛苦,和睾丸的炎症肿胀。此外,没有迹象显示发病率或死亡率展出在所有实验的老鼠实验的时间。这一发现是由不同作者与之前的报道相一致(2、3、14、16、17日,25日,32)。

因此,intratesticular注入的影响溴棕三甲铵2%体重和阴囊宽度在剂量的5、10、15、20毫克白化小鼠进行。有显著增加的体重在一天20也显著减少意味着阴囊宽度在第1天,10、15、20、25、30的白化小鼠实验观察组。此外,减少在大小阴囊触诊intratesticular注射后溴棕三甲铵2%是由于睾丸组织的严重退化,可能呈现实验小鼠不育。最初的睾丸肿胀指出这项研究可能是由于炎性水肿。的睾丸萎缩坏死可能是由于睾丸组织和睾丸腺实质。这些观察结果与之前的研究结果相一致,氯化钙在大鼠睾丸(16、17)。相应地,类似的结果被记录在其它家畜(5、12、25、50)。

组织病理学结果显示,退行性变化与分级剂量溴棕三甲铵。生殖细胞的解体、变性和坏死细精管被发现甚至最低的剂量(5毫克),虽然管室仍完好无损。急剧坏死细精管在小管萎缩是指出10毫克剂量的溴棕三甲铵虽然管室是完好无损。但是,后高剂量(15或20毫克)溴棕三甲铵治疗,完全变性生殖细胞没有明显的边界的细精管和间质纤维化空间观察。这些变化可能是由于溴棕三甲铵的坏死性财产造成广泛的生殖细胞变性,细精管,间质细胞。这一发现与其它报告的结果可比(3、5、17日,23日,25日,51岁,52)使用相同的实验协议;但是,使用一个不同的化学。

此外,这项研究表明,intratesticular注入溴棕三甲铵的男性生殖器官的结构和功能改变包括精生殖细胞变性和坏死,形态改变滋养和睾丸间质细胞和间质和生殖细胞萎缩。基于这些变化,就可以得出结论,intratesticular注入溴棕三甲铵引起不孕。溴棕三甲铵处理后,完成生殖细胞的退化,没有明显的边界在细精管和纤维化的透明组织观察和外观间隙空间。这些变化可能是由于坏死性溴棕三甲铵的性质。类似更改为其他研究人员使用氯化钙,高渗盐溶液,salvon[2、3、12、19、23日25日,32岁的48岁,53)。

退行性变化和总生殖细胞解体15至20毫克的剂量也观察到在细精管,间质和睾丸间质细胞。在cetrimide-treated睾丸生殖细胞的退化可能是介导细胞凋亡。这是由生殖细胞从基底层分离,脱落生殖细胞,细精管和白细胞浸润,间质和睾丸间质细胞的坏死和脱落的不成熟的生殖细胞管腔内的空间。这个结果与其他研究结果不一致(12日,17日,19日,22日,23日,32岁的51岁53-58]。

在高剂量(15至20毫克)溴棕三甲铵治疗,小空间cetrimide-treated老鼠的睾丸部分也表现出显著的退化性变化以及纤维组织的增生。此外,纤维化的小空间在实验老鼠也符合先前的研究使用其他化学药剂(14、17、21、23、32、34)。白细胞的浸润到管状,管周区可能是由于生殖细胞的退化,这可能释放大量的蛋白质,化解了腔的腔的精小管间质,他们作为抗原促进白细胞的趋化作用[2、3、17、25、32、35)。

确认成功的化学灭菌的感应intratesticular注射一溴棕三甲铵,生育功效测试执行。显著减少阴囊睾丸大小宽度和总还原是在所有实验群体除了对照组。相比之下,没有怀孕女性白化小鼠与雄鼠交配后治疗剂量的10,15或20毫克。这可能与生殖细胞的坏死和退行性变化,导致缺乏一个最低要求对待男性的运动型和肥沃的精子数量(3、16、22、26、35 59]。

总之,唯一证明方法到目前为止绝育的雄性动物睾丸切除术和输精管切除术。然而,这两种方法都需要麻醉,充足的手术设施和熟练的兽医和设备,和术后护理。因此,一个双边intra-testicular注入溴棕三甲铵是有效的,经济,和容易执行,不需要切除睾丸。总之,该代理可以用作消毒剂管理失控的增长哺乳动物就像流浪狗,猴子经过进一步调查。

评估的影响开展了实验研究单一双边intratesticular注入溴棕三甲铵2%体重,阴囊宽度,白化小鼠的性行为。此外,睾丸组织的组织病理学评价也执行。当前研究揭示显著增加在所有实验白化小鼠体重20天之后,还有一个显著减少阴囊宽度溴棕三甲铵的白化小鼠intratesticular注射后第一天,10、15、20、25和30在每个实验小组。的基础上睾丸组织学、解体、生殖细胞的变性、坏死细精管被发现即使在最低的剂量。然而,注入溴棕三甲铵2%后在15或20毫克的剂量,完整的生殖细胞退化,缺乏不同的细精管边界,间质纤维化的观察。此外,大幅改变对待男性的性行为观察与性欲减退目前的研究尤其是在20毫克的剂量cetrimide-treated动物。

因此,进一步的研究应该进行更多的实验动物和长时间验证总安全和没有生育能力恢复。此外,不孕不育的机理还不清楚目前的研究;所以在未来应该做进一步评估。进一步调查确定生殖器官的重量,血睾酮和血皮质醇水平,精液体积,应该进行睾丸雄激素的酶。

我欠我真诚感谢博士顾问Guesh Negash期间为他的建设性意见和指导我的论文写起来,我要感谢博士Tilaye Demisse先生为他的帮助在我的组织病理学结果解释和Kidane Werkeleul支持我在病理学实验室的工作。我特别要感谢我最好的朋友和我的家人不可估量的精神上的支持在我的研究工作。

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