新型表面功能化金属掺杂羟基磷灰石的抗癌活性

在这个手稿被描述小说汞掺杂羟基磷灰石(Hap)的合成及其应用对人类肝癌细胞系(消息灵通的G2)和人类肺纤维母细胞癌细胞系(MRC 5)。纳米羟磷灰石掺杂Hg2 +合成,随着汞离子的一个化学法为基础的解决方案。采用磷酸甲乙基亚氨基二乙酸(PMIDA)对掺杂羟基磷灰石(MHAp)纳米粒子表面进行功能化，使其稳定为具有负zeta电位的分散相。红外光谱测量证实了表面功能化。采用XRD、FESEM和AFM等方法研究了结晶性质、形貌和表面拓扑结构。通过HRTEM图像获得分散良好的样品的粒径。采用WST法测定了掺杂汞的纳米颗粒(MHAp)对Hep G2和mrc5细胞活力的影响。观察到纳米复合材料对mrc5细胞系表现出位点特异性作用，并降低了对正常细胞的毒性。

纳米技术代表了一种新的和启用平台，承诺为生物医学应用提供一系列创新协议。在许多生物医学应用中，纳米粒子，例如纳米颗粒，纳米棒，纳米线，纳米管和纳米纤维是由于其新的性质和多功能性。羟基磷灰石[CA._10.（PO._4.的）_6.（哦）_2.]（HAP）是一种有趣的生物材料，由于其优异的生物相容性、生物活性和骨传导性，具有潜在的骨科和牙科应用[1-3]。然而值得一提的是，纯HAP由于其硬度和化学稳定性，其应用受到限制。然而，近年来，HAp聚合物复合材料因其良好的生物学和力学性能[4-6]以及在胶原基质中的分散性[7]而受到重视。有时，纳米羟基磷灰石（nHAP）晶体与基于有机磷酸盐和膦酸的偶联剂[13-20]一起分散在合适的聚合物基质[8-12]中，用于各种应用。

过渡金属因其体外毒性而广为人知;然而，由于其位点特异性靶向能力[21-23]，人们正在努力将其应用于抗癌活动[21-23]，以减少传染性癌细胞。汞及其化合物因其高毒性而广为人知。持续摄入汞(II)会导致水俣、肢端痛和亨特-罗素综合征等有害疾病。然而，极低浓度的汞输送到受癌症影响的细胞系可能作为替代抗癌剂，其毒性预期低于铂化合物用作抗癌剂。羟基磷灰石具有生物相容性和无毒性质，因此低浓度的汞金属离子的掺杂可以在一定程度上降低金属离子的毒性。以汞为基础的化合物，如硝酸苯汞和醋酸苯汞曾被用作抗菌剂，特别是硝酸苯汞[24,25]，但目前还没有使用汞作为抗癌剂的研究报告。口服汞基化合物由于其与蛋白质的非特异性结合而产生毒性，因此我们的目标是将汞掺杂纳米复合材料合成为生物相容的纳米材料，以消除与蛋白质的非特异性结合，避免意外的毒性。

本研究采用溶胶-凝胶技术将汞离子嵌入到羟基磷灰石纳米颗粒中。为了避免纳米复合材料的吞噬作用;用磷酸甲乙基亚氨基二乙酸对表面进行功能化。因此，在粒子表面接枝羧酸基团使纳米复合材料在水中或生物流体中具有更稳定的生物相容性和分散性。然后对肝癌细胞系(Hep G2)和肺癌成纤维细胞系(mrc5)进行表面功能化羟基磷灰石掺杂汞的实验体外细胞毒性研究。值得注意的是，纳米复合材料（MHAP）向MRC 5细胞系显示毒性，而对HEP G2细胞没有揭示毒性。迄今为止，尚未向日期报告细胞毒性掺杂羟基磷灰石（MHAP）。因此，我们的动机是开发独特的羟基磷灰石（NMHAP）的汞掺杂表面官能化纳米颗粒及其作为抗癌剂的应用。该材料有两个主要优点：

(1)整个过程中使用的前驱体价格低廉，易于合成。

（2） MHAp纳米粒子对肺癌成纤维细胞系（mrc5）具有位点特异性抗癌活性，而对肝癌细胞系（hepg2）没有毒性。因此，纳米复合物毒性的降低将纳米复合物作为抗癌剂转向肺成纤维细胞系。

化学物质

硝酸钙(99%)、磷酸氢二铵(DAHP)(99%)、氯化汞均从默克公司(印度)获得。三乙醇胺(TEA)(98%)和磷甲乙基亚氨基二乙酸购自Sigma-Aldrich。氨水(25%)，氯化铵(98%)和乙醇也从默克公司(印度)获得。所有的化学物质都是分析级的，使用时无需进一步提纯。所有生物测定均采用milliq级水(赛多利斯-斯特迪姆生物技术公司)，其电导率小于0.1 μ S cm^－1．

细胞系

MRC 5和HepG2细胞系购自ATCC（目录号CCL-171和HB-8065）。所有培养物均保存在无酚红培养基DMEM/F12（Dulbecco改良基本培养基/Ham's 12营养混合液，Gibco）中，并添加5%（v/v）胎牛血清（JS Bioscience，澳大利亚）和1%（v/v）抗生素（2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素；Gibco）。培养的细胞保持在37ºC的湿度为5%的CO_2.孵化器。一旦细胞达到融合，从烧瓶中取出培养基，用无菌HBSS(汉克平衡盐溶液，Gibco)冲洗细胞三次。用胰蛋白酶/EDTA (Gibco, USA)酶解去除融合细胞层，并重新悬浮在培养基中。台盼蓝活体染色检测细胞活力(0.4% (w/v);Sigma，美国)，并用光学显微镜(卡尔蔡司)测定细胞数量。

掺汞纳米羟基磷灰石的合成

掺汞羟基磷灰石是通过修改先前报告的方法合成的[14]。简言之，0.5（M）硝酸钙原液Ca（NO_3.的）_2..4H_2.o，0.5（m）的磷酸二铵（NH4）_2.HPO_4.(DAHP)和0.01 (M)的氯化汞溶液在蒸馏水中。取适量硝酸钙和磷酸氢二铵溶液，使Ca:P的净原子比保持在1.67。采用三乙醇胺(TEA)与硝酸钙结合，作为沉淀过程中的粒径控制剂。用稀氨将硝酸钙和磷酸氢二铵溶液的最终pH保持在~11-12。将DAHP溶液和10ml 0.01 (M)氯化汞溶液滴加到硝酸钙和三乙胺的混合物中，在环境温度下用机械搅拌器3000rpm剧烈搅拌。将反应混合物搅拌约6小时，产生凝胶状沉淀物。沉淀物4000rpm离心15分钟。用水和乙醇氯化铵彻底清洗沉淀，以去除多余的TEA。最后将获得的产品在90°C下干燥15小时。

嫁接表面上的羧酸

以磷酸甲酰基亚氨基二乙酸(PMIDA)为原料合成了羧酸功能化汞掺杂羟基磷灰石(nMHAP)。简而言之，将大约500毫克的纳米复合材料放入25毫升蒸馏水中，并在超声浴中保存约45分钟，直到得到分散良好的溶液。在此分散良好的样品溶液中滴加PMIDA碱性溶液，保持摩尔比例为1:1，在整个添加过程中保持碱性pH为9。反应混合物搅拌6小时;最后4000rpm离心15分钟。产品用蒸馏水洗涤几次，以去除多余的PMIDA，并在60°C的温度下干燥。羧酸接枝纳米复合材料在水分散体系中非常稳定;该功能化复合材料用于生物测定。

表征

利用卡尔蔡司的SUPRA 40场发射扫描电子显微镜（加速电压为5.0kV）对纳米复合材料的形貌进行了研究。对于FESEM样品制备，将试样的水溶液置于适当清洁的载玻片上，然后旋涂。样品的XRD在Bruker D8仪器中进行，使用主光束单色仪选择所用铜辐射的Kα1成分（波长1.54056Å）。XRD样品的制备方法是将样品沉积在玻片上，然后在空气中干燥。FTIR光谱记录在Perkin Elmer spectrum 100中。在FTIR测量之前，样品用KBr（光谱级）研磨并压制成颗粒。采用原子力显微镜（TS150）在攻丝模式下获得了掺汞纳米羟基磷灰石（nMHAP）的表面形貌。在粒度分析仪（90 Plus，美国布鲁克海文仪器公司）中使用动态光散射（DLS）测量样品的流体动力学半径和粒度分布（PSD）。在200 kV的工作电压下，使用Phillips CM 200的HRTEM确定颗粒大小。对于HRTEM显微照片，将分散良好的样品水溶液放入均匀的镀铜TEM网格中，并在空气中充分干燥。对于毒理学研究，使用岛津吸收分光光度计（型号1700）测量样品的OD。

WST法检测mrc5和HepG2细胞株的细胞毒性

该分析是基于活细胞中存在的细胞线粒体脱氢酶将四唑盐WST-1酶转化为福玛氮。简单地说，用8通道移液管将培养的细胞稀释到30000个细胞/ ml，然后在96孔板上除最后一列外，每孔加入100µl混合均匀的细胞培养物。平板在CO中培养_2.孵化器过夜。然后通过使用8通道移液管分配器在25,50,100,200ppm浓度下分别在25,50,100,200ppm浓度下添加NMHAP，用阳性（培养基中的培养基）和阴性对照（MEDTA处理中的细胞）。孵育72小时后，将WST-1增殖试剂（Roche）加入细胞中（每孔10μl），并在37℃下继续孵育4小时。通过比较填充用处理过的细胞（粉红色）和未处理细胞的孔的颜色显示橙色的颜色来检查平板。当通过肉眼看到透明差异时，通过490nm的分光光度计检查结果。

体外细胞毒性数据的剂量-反应曲线

不同浓度的NMHAP和控制孔中可活细胞的百分比对分光晶仪进行了不同的光密度值。从这些绘制的吸光度数据以图形方式绘制剂量响应曲线。

通过动态光散射记录合成的掺汞纳米羟基磷灰石（nMHAP）的粒度分布（PSD）和流体动力学半径，方法是使用在25º下以θ=90º的角度散射的激光（λ=660nm），将分散体放置在玻璃试管中。在试管中取出稀释良好的milli-Q水样品溶液，并在超声波浴（Branson）中进行30分钟的超声波处理。沉淀10分钟后，再次用相同比例的milli-Q水稀释溶液，并在溶液超声处理30分钟后进行测量。平均粒径为400nm，多分散指数为0.255。和纳米复合材料的实际尺寸相比，DLS结果要高得多，因为它显示了纳米复合材料的流体动力学半径。

图1A，B表示NMHAP的低分辨率FE-SEM图像。揭示官能化掺杂纳米复合材料本质上是完全杆状，INSET图像显示了单个杆状结构。形态学完全明确，然而，在我们的显微照片中未获得形态的混合物。

样品的结晶性质由x射线衍射仪测定，在x射线照射前，样品被沉积在适当清洁的玻片上并干燥。图2a为未经表面改性的纯纳米羟基磷灰石的XRD谱图，有12个清晰可见的峰。2θ = 25.92º、28.09º、29.03º、31.92º、32.91º、34.31º、39.94º、43.92º、46.88º、49.61º、53.44º、64.20º的衍射峰分别对应于(002)、(102)、(210)、(211)、(300)、(202)、(130)、(113)、(222)、(213)、(004)和(323)六角形羟基磷灰石衍射面[JCPDS卡编号]。74 - 0566][26]。而对于nMHAP, 2θ = 25.92º、28.09º、29.03º、31.92º、32.85º、34.13º、39.57º、43.77º、46.69º、49.43º、53.25º和64.01º的衍射面几乎没有变化。因此，在羟基磷灰石的晶体结构中掺杂了非晶态的汞离子，保持了天然羟基磷灰石的晶体结构不变。

红外光谱进一步证实了掺汞羟基磷灰石表面功能化的成功。FTIR光谱显示7个特征峰，如图3所示，其中3436 cm^－1是用来拉伸O-H的峰值出现在2914厘米处^－1显著的C-H拉伸和羧酸的C=O拉伸频率出现在1650cm处^－1. 峰值出现在1380厘米处^－1和1106厘米^－1分别针对C-O-H弯曲和C-N拉伸的特点。然而，较低的峰值在614厘米^－1和1036厘米^－1被认为是阿宝_4.^3-和P-OH基团[26]。

通过原子力显微镜获得表面形态，其揭示了制造的纳米复合材料的棒结构，平均尺寸为40nm，平均粗糙度为9.44nm。图4A显示了AFM图像，图4B显示了其3D图与直方图一起的表面形态。

通过高分辨率透射电子显微镜确定合适的粒径。图5显示了HRTEM显微照片，该照片显示所制备的掺汞纳米羟基磷灰石颗粒为棒状。粒子的平均尺寸在20纳米到50纳米之间。颗粒清晰可见，未发生团聚，这也符合AFM结果。SAED图谱进一步证实了颗粒的晶体结构（图6）。EDAX分析证实了化学成分，表明Ca、P、O和Hg是主要化学成分（见补充信息S1），样品中汞含量接近23%。

nMHAP纳米颗粒对MRC 5细胞系有细胞毒性反应。在这种情况下，76.44%、71.87%、58.39%和34.98%的细胞在分别与25、50、100和200 ppm浓度的nMHAP孵育72小时后存活，如图7a所示。在HepG2细胞系上以相同剂量进行nMHAP处理的情况下，在72小时的实验后，几乎所有细胞都存活，这意味着nMHAP对HepG2细胞几乎无毒（图7b）。虽然汞本身具有毒性，但nMHAP治疗会影响特定的癌细胞系。此外，使用生物相容成分掺杂可能有效降低其毒性。这一独特的结果表明，通过掺杂生物相容性成分，汞等有毒成分的细胞毒性可以在一定程度上降低。纳米颗粒诱导的细胞毒性可归因于多种机制，其中包括通过上调细胞膜上的Fas、膜损伤以及与颗粒内吞相关的细胞内效应诱导颗粒诱导的细胞凋亡。Fas的上调表明与抗癌活性有关[27]。这在这一点上肯定是推测性的，需要进一步仔细研究，特别是解释对癌细胞的选择性毒性。

这篇手稿描述了在生物相容的羟基磷灰石上掺杂有毒的汞离子。采用原位汞离子溶胶-凝胶法合成了羟基磷灰石。FTIR研究证实，通过使用PMIDA将羧酸接枝到纳米复合材料表面，对纳米复合材料进行功能化。高分辨率TEM图像显示，颗粒呈均匀的棒状，大小在20-50nm之间。这种纳米复合物对人成纤维细胞系MRC 5显示出独特的位点特异性作用。虽然nMHAP对MRC5细胞有毒性，但对肝癌细胞株HepG2没有毒性。回归法发现MRC5的LD-50为133.13 ppm。

虽然汞在本质上是有毒的，但它对HepG2细胞没有毒性。肝脏是储存有害物质和清除毒素的器官。常用的化疗药物对肝细胞造成重大损害。由于这种nMHAP对肝细胞无毒，因此它可能是治疗部位特异性癌的首选药物，具有最小的毒性嗯副作用。

我们要感谢ISI计划项目的合作努力和慷慨的资金支持。

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