艾Naphta:一种新型石油提取和易发痤疮皮肤敏感

背景:这种植物青蒿被用于中药很多年了。丰富的生物活性分子,黄花蒿植物用于提取青蒿素抗疟化合物(< 1%),导致大部分的工厂被闲置。青蒿素提取的一个副产品是艾挥发油(一个),它还没有被广泛的研究。

目的:研究小说石油提取物对微生物的活动,促炎细胞因子,和皮肤端点湿疹,痤疮发病机理的关键可以确定一个有效黄花蒿提取这些皮肤病可以发达。

方法:气相色谱分析-质谱法进行确定石油的成分。p•曼秀雷敦,金黄色葡萄球菌,m .头皮屑,白念珠菌被培养来确定最小抑制浓度。在体外研究利用角化细胞和巨噬细胞治疗与石油和基因表达的定量rt - pcr。13-subject临床试验执行1%的石油凝胶来评估其潜在益处对易于敏感和粉刺的皮肤。

结果:油丝相关蛋白基因表达上调和具有抗菌和抗炎活性抑制LPS,金黄色葡萄球菌”和“Th2诱导炎性介质释放(il - 6,引发和TSLP)。临床评估1%的凝胶显示它能减少粉刺瑕疵和发红的外观。

结论:之前没有得到充分利用,unpurified副产品,现在是来源开发第一个局部化妆品使用的石油活动概要文件表明它是有效的对那些敏感的和/或痤疮皮肤。

青蒿(黄花蒿)是一种一年生草本中药用于治疗疟疾和发烧[1]。源自青蒿素抗疟活性,也被证明有抗病毒、抗癌,anti-fibrotic,抗炎,抗菌性能[2]。青蒿素[3],它的衍生品[4]黄花蒿提取物富含类黄酮[5]也被证明能减少炎症和皮肤接触致敏当局部使用。青蒿素的提取黄花蒿收益率只有少量的生物活性分子(0.1 ~ 0.7%)[6],导致的黄花蒿提取和许多其他生物活性分子[2]将未使用的。最近的一份报告显示黄花蒿提取减少发红,发炎和改善皮肤屏障修复[7]。由于中国法规规定禁止使用青蒿素的化妆品,我们试图开发一种新型的局部黄花蒿提取从当前青蒿素提取副产品,工作同时提高提取的环境足迹,并可能为皮肤提供许多好处。

一个副产品从青蒿素提取黄花蒿粉是艾挥发油(一个)。到目前为止,研究相对于其他的是有限的黄花蒿提取物。一份报告表明,它是由几个酚醛树脂、萜烯,导致抗菌活性[8]。如前所述,黄花蒿提取表明承诺在促进健康的皮肤。这里描述的小说一个石油被精馏提纯获得高沸点成分(> 90°C)。因此,相比更为常见,研究水提取的黄花蒿,这一个石油提取更亲脂性的暗示其生物活性分子将更有效地穿透皮肤。此外,黄花蒿水提取物含有叶绿素,很难消除它的颜色作为一个局部形成发展的障碍。相反,一个石油提取,由于温度升高过程,包含杂质更少,批次一致的质量和它的淡黄色的颜色更适合被用于许多不同的配方类型。

这里,我们第一次证明,这种新的石油提取具有广泛的抗炎作用,减少促炎细胞因子il - 6等引发和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的一个关键标志发痒。此外,我们将展示一个石油提取中间丝相关蛋白上调,表皮分化的关键蛋白,扩大我们对其抗菌活性的理解,因为它能抑制等微生物的生长c·曼秀雷敦和金黄色葡萄球菌发挥重要作用在痤疮,湿疹的发病机理。我们描述油提取的成分,报告最丰富的生物活性分子的樟脑、莰烯,p-cymene, eucolyptol D-limonene。最后,在人类受试者临床结果证明1%的石油制定凝胶和局部使用耐受性良好,有效地减少瑕疵和发红易发痤疮皮肤的外观。

试剂

所有化学品都来自Sigma-Aldrich有限公司(密苏里州圣路易斯和ThermoFisher(沃尔瑟姆,MA)。艾naphta(一)提供的石油提取KPC制药、公司。

艾naphta采油

黄花蒿叶子与石油醚加热,导致石油过滤。浸出溶液被加热和蒸发去除石油醚。石油蒸馏在100 - 110°C,然后排水获得原油的石油。原油产品的石油将被放置在一个炼油罐,加热到110°C 30分钟,然后冷却。硅胶添加到油,搅拌30分钟,然后过滤使脱色油提取。

gc - ms分析

一克石油提取样本用乙醇稀释到10% GCMS分析。分离是一个安捷伦HP-5MS列上执行(30米* 0.25毫米* 0.25µM) 1毫升/分钟的流量、分流比(20:1),洗提液气体(> 99.9%)的温度程序60°,230°、240°、280°C。

电子电离(电离能= 70 ev)是利用扫描范围的29 - 550年阿姆河,溶剂延迟2分钟和230°C温度女士为四极源和150°C。样本获得的总离子流图,确定了各种组件。每个组件的相对含量的样本是由峰面积归一化。

抗菌检测

所有抗菌测试是由第三方机构——Hozan实验室和广东省Biocell生物技术(上海,中国)。简而言之,Cutibacterium曼秀雷敦应变(10312年中金)在脑心浸液琼脂培养(BHIA)在厌氧条件下。石油中提取了BHIA最终浓度从0.1 -50毫克/毫升。固定1µl细菌悬液在琼脂扩散板和孵化48 - 72小时37°C。细胞死亡头皮屑(写明ATCC^®44344年^TM)在媒体在厌氧条件下培养。石油提取物添加到媒体最终的浓度从0.5 -200毫克/毫升。固定1µl细菌悬液在琼脂扩散板和孵化48 - 72小时37°C。孵化后,盘子被放在一个黑色的,非反射背景阅读结果。金黄色葡萄球菌(写明ATCC^®6538年^TM),白色念珠菌(写明ATCC^®10231年^TM在有氧条件下)在营养肉汤培养。石油提取物添加到媒体最终的浓度从2.5 -400毫克/毫升。固定100µl细菌悬液在琼脂扩散板和孵化48小时37°C。所有压力测试,细菌悬液制备的浓度1 x 10⁸10 CFU /毫升~ 2 x⁸作为最初的培养液CFU /毫升。最低抑制浓度被定义为最低浓度,抑制可见细菌的增长。

细胞培养

所有在体外细胞是由上海工作Archgene sgn生物科学生物技术有限公司(中国)和(美国)。简而言之,生264.7老鼠巨噬细胞从细胞库购买,中国科学院(猫。tCM13)。生264.7巨噬细胞在DMEM维护包含10%的边后卫在37°C公司为5%₂。当细胞达到90%融合,细胞被播种在96孔板的密度每毫升8 x105。8小时后,细胞治疗不同浓度的样品和孵化24小时。细胞被随机分成不同的组和co-treated有限合伙人(1μg /毫升)和测试材料根据最大无毒浓度由CCK-8工具包(密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich有限公司)。地塞米松(20μM或80μM)作为积极抗炎控制。72小时后,收集细胞上清液对il - 6 ELISA测量(eBioscience,圣地亚哥,CA)。正常的人类表皮角化细胞(这些)新生儿捐助者买来ThermoFisher(沃尔瑟姆,MA)和讲究的在体外在EpiLife®中补充了香港在正常细胞培养条件(37°C, 95% v / v, v / v公司5%₂),随机分为治疗组根据最大无毒浓度由MTS工具包(Promega,麦迪逊,WI)。48小时后,测试和控制材料的细胞培养基和培养1小时标准培养条件(37°C和5%的股份有限公司₂)。治疗后,媒体是生活所取代金黄色葡萄球菌(写明ATCC^®29213年^TM;1 x 10⁷新鲜EpiLife CFU /毫升)^®媒介与测试材料和孵化24小时。孵化后,培养基上层的收获,用来测量引发(BD生物科学,圣何塞,CA)和TSLP(研发系统、明尼阿波利斯、MN) ELISA。这些治疗与il - 4 / IL-13 (30 ng / mL)有或没有样品72小时基于最大无毒浓度和细胞上清液收集测量引发ELISA。

基因表达

主要人类角质细胞co-treated样品和il - 4和IL-13 (30 ng / mL)为72小时。上层清液被丢弃和细胞总RNA提取被清洗和收集。RNA是反向转录cDNA FLG存在基因表达测定。分析的数据是2^-ΔΔCt的方法。

临床研究

临床试验在健康的志愿者是由上海Kunyao生物技术有限公司有限公司(中国)。与13个主题,这是一个单盲研究中,年龄从18岁到40年,所有易发痤疮皮肤炎症性皮炎,包括丘疹和脓疱。这项研究是根据的原则进行良好的临床实践和遵循赫尔辛基宣言的伦理原则。研究协议的伦理审查委员会批准上海Chicmax化妆品有限公司(IRB)。主题报告的测试设施基线筛选时间知情同意。所有科目填写及签署文档声明,“承诺自愿参与的人体试验测试化妆品和参与人类的试用期。对象使用一个凝胶(1%随意)2周将它应用于脸上瑕疵和皮肤参数收集的非侵入性的皮肤测试仪,包括VISIA®cr(坎菲尔德科学、费尔菲尔德、新泽西)面部成像在基线和消费者自我评估问卷,第三天,第七天,14天。临床试验进行按照临床试验方案,我指导质量管理实践的临床试验和所有适用的法律法规。

统计分析

基因和蛋白表达分析,样本化验一式三份。统计学意义是取决于学生的学习任务比较测试使用p——值小于0.05的显著差异。在临床研究中,成对的单向方差分析是用来评估受试在基线改进。

表征艾挥发油(一)石油提取物的化学成分

典型的青蒿素的提取工艺黄花蒿粉导致非易失性化合物(包括青蒿素)和副产品等挥发组分。一个主要由萜类化合物和酚羟基官能团例如桉油精,terpinen-4-ol,丙酸α-terpinylβ-pinene [8]。使用这种副产品作为起点,然后执行蒸馏和精馏步骤在110°C,其次是脱色的一部小说,纯化石油提取。利用gc - ms分析,小说一个石油提取物的化学成分特征。我们确定了桉油精作为主要组件出席类似的水平(5.2%)[8]和我们的石油提取(5.6%,表1)。Eucalytpol(也称为8-cineole) mint-like气味,除了其抗菌活性也是一个强大的皮肤渗透剂[9]。最丰富的化合物中发现的石油提取樟脑(23.7%,表1),一个萜类化合物已被报道提供许多好处,包括皮肤伤口愈合性能和抗皱活动[10]。莰烯(又名β-pinene)和p-cymene两个额外的萜烯存在石油提取分别为16.2%和13.9%。这些化合物都是为了拥有广泛的活动,包括抗氧化、抗炎、止痛[11],抗菌和抗真菌特性[12]。此外,随着他们的抗菌活性,莰烯和p-cymene是发现在许多不同的商业精油用于治疗皮肤疾病,包括湿疹、痤疮[13]。其他一些化合物,促进皮肤健康也确定在我们的石油提取和yable 1中列出。

一个石油提取物具有抗菌活性

之前它已经被证明黄花蒿提取[2]和艾挥发油(一)[8]拥有对几种微生物包括抗菌活性c·曼秀雷敦和金黄色葡萄球菌痤疮的发病机制中起重要作用,特应性皮炎(14、15)。此外,黄花蒿提取物也被证明有很强的抗真菌活性[16]。调查一个油提取潜在的抗菌和抗真菌特性,我们测试的最低抑制浓度(MIC)和前面提到的皮肤细菌,c·曼秀雷敦和金黄色葡萄球菌以及两个真菌在皮肤细胞头皮屑白色念珠菌。对石油提取证明抗菌活动c·曼秀雷敦和金黄色葡萄球菌,MIC值分别10毫克/毫升和5.6毫克/毫升(表2)。同样,一个石油提取物也表现出抗真菌特性抑制m .头皮屑(麦克风= 5毫克/毫升)白念珠菌(麦克风= 10毫克/毫升)。4-Terpineol,通常存在于t树油和被称为一种抗菌化合物,用作积极控制,是有效的(表2)。

我们在这项研究证明,一个石油,艾挥发油的提取,通常忽视当处理黄花蒿青蒿素,提供了一些对皮肤有益。根据本文提供的数据,最好可以解释为这部小说一个石油提取物的化学成分。通过gc - ms分析,我们确定了一个石油提取包含几个萜烯包括三个最丰富的化合物,樟脑(~ 24%),莰烯(又名β-pinene)(~ 16%)和p-cymene(~ 14%),所有这些都曾被报导过拥有皮肤保护属性如伤口愈合、抗衰老、抗氧化、消炎(10、11)。独特的混合皮肤活性物中确定石油提取可能更有效,当局部使用的皮肤给桉油精的存在(~ 6%),这是一个已知的渗透剂[9]。桉油精可能有助于推动石油提取物的生物活性分子进入皮肤和最大化油提取的有效性。完全,产生这一个石油从材料中提取以前副产品提供了一个“双赢”的场景,我们减少环境足迹的青蒿素提取黄花蒿和发展一个有效的石油提取皮肤。

青蒿素已经被广泛的研究由于其制药应用,但是目前在中国禁止使用化妆品的成分,因为它是一个制药剂用于治疗疾病。然而,植物黄花蒿是一种常用的中药和批准用于化妆品使用。为此,使用黄花蒿提取物在化妆品最近开始出现。在去年发表的一项研究,Yu等人证明黄花蒿提取人体临床试验中增加水化,降低表皮水分损失(TEWL)和炎症信号有效性为敏感皮肤[7]。这些令人鼓舞的结果和目标的基础上利用很少使用副产品的利用存在于许多生物活性分子黄花蒿,我们试图开发第一个artemisinin-free黄花蒿提取化妆品使用。从生产和配方的角度来看,电流黄花蒿水提取存在难以克服的几个挑战。首先,他们含有叶绿素,使它的颜色难以消除和限制其能力被用于广泛的配方类型。相反,一个石油提取淡黄色的颜色更适合各种配方类型包括白色的霜和口罩。此外,使石油产量的过程中提取高纯度和批次的变化比黄花蒿水提取物。我们首次展示,使用一种新颖的艾naphta派生石油提取局部使用时有效减少粉刺瑕疵和发红的皮肤(图4,表3)。这个概念验证的临床研究表明,1%的石油提取制定凝胶不仅是良好的,但有效的。此外,7天后,62%的受试者报告减少疼痛和瘙痒,表明这一效应可能是由于部分抑制TSLP,如图2所示。油提取的鼓励在体外概要文件证明抗菌性(表2)对TLR4与抗炎活性,金黄色葡萄球菌和Th2反应,表明石油提取可能有多个应用程序在皮肤护理包括改善痤疮和敏感的皮肤。这也是在利用RBX的概念验证临床研究^®成像可视化炎症,我们看到减少红色区域地图图像,表明石油提取物的抗炎作用是局部使用时有效。石油中提取潜在的皮肤保护属性的进一步支持在体外这里给出的数据显示它还可以促进健康的皮肤屏障功能的移植栏目(图3)。我们的下一个目标是进一步调查石油提取在调制TLR信号中所起的作用,相比之下它在运行vehicle-controlled临床研究活动对青蒿素和它的潜在好处在主题和易发痤疮皮肤敏感。

我们在这里展示的利用率黄花蒿提取副产品作为源,随后发现小说丰富的石油提取大量的萜烯为皮肤提供许多好处。石油对几种微生物包括提取物具有抗菌活性c·曼秀雷敦和金黄色葡萄球菌,这都与痤疮,湿疹。此外,一个石油提取显示阻止TLR4、金黄色葡萄球菌中间丝相关蛋白和il - 4 / IL-13诱导炎症和移植,所有之前已被证明是痤疮,湿疹发病机制的关键。最后,在人类临床研究中,局部应用1%的凝胶,据报道,减少瑕疵和发红的科目。完全的在体外这里介绍和临床数据显示油提取有效的对于那些敏感和/或易发粉刺的肌肤。

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