伪麻黄碱保护小鼠免受H₁N₁病毒

麻黄是一种古老的草药，在中国长期被用于治疗普通感冒和流感。伪麻黄碱是麻黄的主要活性成分，临床上用于缓解鼻塞。我们以前报道过伪麻黄碱除了具有拟交感神经作用外，还具有强效的抗炎作用。在本研究中，我们旨在研究伪麻黄碱是否能保护小鼠免受H₁N₁病毒感染。用20% LD50 a型流感病毒(IAV)悬液经鼻给药感染小鼠，建立病毒感染模型。此外，小鼠在感染后1天内口服伪麻黄碱或奥司他韦4天。结果表明，与病毒感染对照组相比，伪麻黄碱可改善IVA感染期肺病理损伤，显著提高存活率和减轻体重损失。此外，伪麻黄碱还能抑制TLR7信号通路的细胞因子风暴和mrna表达。令人惊讶的是，伪麻黄碱对IAV的复制有抑制作用。这些结果为伪麻黄碱是一种潜在的抗流感药物提供了明确的证据，通过减弱细胞因子风暴和抑制IAV的复制，根据这些结果，我们推测它应该在新型冠状病毒肺炎(COVID-19，其中，细胞因子风暴在早期对支气管和肺的损伤中起着关键作用。

人类一直在与流感作斗争，直到现在。近年来，包括禽流感、传染性非典型肺炎和当前新型冠状病毒COVID-19在内的大流行病毒是危及生命的呼吸道疾病。这些疾病已成为世界范围内严重的公共卫生问题，在许多发展中国家，这一问题是毁灭性的。众所周知，流感疫苗的开发普遍滞后，已经开发了一些治疗流感的靶向药物，如奥司他韦，但其效果成本效益较低，并从世卫组织[1]的推荐名单中删除。必须找到有效的药物。

麻黄在我国临床使用时间如此之长。麻黄治疗感冒和流感的记载，见《伤寒论》(商汉伦)，是中国古代传统医学文献。根据以往的报道[2,3]，我们推测麻黄及其主要生物碱伪麻黄碱和麻黄碱在流感治疗中应该有很大的疗效，而且更经济。伪麻黄碱和麻黄碱已在临床上作为肾上腺素能药物使用。然而，目前的研究主要集中在其拟交感神经作用上，而事实上，其具有良好的抗炎活性[3]。伪麻黄碱被FDA批准用于鼻塞减充血剂[4]，其拟交感神经作用低于麻黄碱。我们认为，伪麻黄碱可能是一种潜在的流感炎症抑制剂。

动物

无特异致病菌C57BL/6小鼠96只，雌雄各占一半，体重20±1 g，购自广东省医学实验动物中心。将小鼠置于相对湿度为(23°C±1°C)和(50%±5%)的可控环境中，自由获取食物和水，光照/黑暗周期为12小时，持续14天。实验在暨南大学实验动物伦理委员会的监督和评估下进行。所有实验程序均遵守1988年中国委员会批准的《实验动物管理条例》。

分组，病毒和治疗

组：将小鼠随机分为以下四组，每组24只：

A组：正常对照组（正常对照组）；

B组:IAV con控制集团(V con）;

C组：IAV+oseltamivir治疗组(奥司他韦)（奥司他韦，195 mg/kg，po）；

D组:IAV + PE治疗组(V体育)(伪麻黄碱30 mg/kg, po)。同时，将小鼠随机分为四组(每组5只)进行生存实验。

病毒

病毒株：A型流感病毒，FM1小鼠肺适应株(FM1)，储存于-80°C。由暨南大学基础医学院微生物与免疫学教研室提供。常规鸡胚复苏2次后血凝滴度为1:40。采用双倍稀释法测定不同浓度病毒感染小鼠14 d后的死亡率。采用小鼠死亡率20%(凝血效价1:640)的病毒浓度，每只小鼠灌服50 μL病毒液。

复合

伪麻黄碱购自广州医药生物制品控制研究所（中国），伪麻黄碱纯度>98%。磷酸奥司他韦胶囊从宜昌长江东方阳光制药有限公司（中国）获得，纯度>98%。

治疗

奥司他韦的剂量是基于之前的研究[5]，伪麻黄碱是基于我们的预实验。B、C、D组小鼠经乙醚吸入完全麻醉后，第1天鼻滴20% LD50 FM1流感病毒混悬液感染小鼠。这种手术会导致上呼吸道和下呼吸道感染。A组小鼠吸入乙醚麻醉后给予生理盐水。第2天开始药物治疗(C、D组)。流感病毒感染后，PE或奥司他韦溶于生理盐水腹腔注射4天。B组每只小鼠每天腹腔注射1ml生理盐水。每组8只小鼠分别于第2、4、6天实施安乐死。

生存实验

口服给药前2小时，用稀释病毒(10 × LD50)经鼻攻击小鼠。用等量的病毒稀释剂向正常对照组小鼠鼻内刺激。然后每天给小鼠口服一次，连续7天。所有组均于感染后监测14天。每天记录小鼠体重和数量。计算患者的寿命和生存率。体重变化显示为病毒感染前一天小鼠体重的百分比。此外，观察到的临床体征包括皮毛皱折、眼、鼻或嘴周围发红、驼背、呼吸改变和无反应。

组织病理学检查

取肺标本。取0.5 cm的肺组织进行分析，用4%多聚甲醛固定，用刀片修整修整。选择合适的肺部分，按漂洗、脱水、透明剂处理、浸泡等步骤进行处理。切片后经干燥、脱蜡、水合等步骤处理，苏木精、伊红染色。取组织切片，观察中央组织组织。用于分析的微观场的大小为200X。

RT-qPCR检测甲型流感病毒TLR7、MyD88、MAVS、RIG-I、NF-kappa B p65 mRNA及肺组织相对表达量

取肺标本。使用定量实时逆转录酶PCR（RT-qPCR）检测TLR7、MyD88、MAVS、RIG-I和NF-kappaB的mRNA表达，以及肺内IAV复制。根据制造商的说明，总RNA由RNAiso Plus（日本TaKaRa，Cat.#9108）提取。根据制造商的说明，使用CFX Connect实时PCR检测系统（美国BIO-RAD）和PrimeScript RT试剂盒（RR047A，TaKaRa）以及SYBR Premix EX Taq II（RR820A，TaKaRa）进行cDNA合成和实时PCR。引物由中国上海通用生物技术有限公司合成。RT-qPCR的所有引物见表1。RT-qPCR后，使用2−ΔCT法。每个样品测量三次并取平均值。细胞中的基因表达奥司他韦和V体育是相对于V con．

细胞因子的测量

通过ELISA测定细胞因子水平。通过小鼠TNF-α或小鼠IFN-γELISA Ready SET Go！测定血清和肺组织中的细胞因子含量！根据制造商的说明进行2 x 96测试（美国ebioscience分类号8588732422和分类号8588731422）。简而言之：通过特定的小鼠细胞因子特异性免疫捕获抗体从血清和肺组织捕获细胞因子，该抗体结合在96孔微量滴定板的固相上。在40℃下过夜培养后检测检测细胞因子。将针对每种细胞因子的生物素结合检测器抗体添加到反应混合物中，随后与辣根过氧化物酶结合抗生物素一起孵育。然后，在30分钟后，添加含有过氧化氢的底物四甲基联苯胺。反应在1mh后停止₂所以₄通过在ELISA阅读器Epoch 2（BioTek Instruments，Inc.，佛蒙特州和美国）上测量450和570 nm处的吸光度来评估颜色反应。根据制造商的说明，根据校准曲线计算特定样品（pg/100μl）中的细胞因子浓度。

统计分析

使用SPSS 22 for Macintosh（IBM软件，美国纽约）进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差表示。使用单因素方差分析对各组进行比较，然后进行事后学生纽曼-基尔斯测试。计算凝胶分析和条带密度测定得到的蛋白质条带密度值。这些值表示为每个样本的TLR7、NF-kappaB或MyD88/GAPDH比率。采用方差分析和纽曼-凯尔斯检验对不同组的平均值进行比较。A.P<0.01的值被认为具有统计学意义。

伪麻黄碱能显著提高黄颡鱼的存活率和体质量₁N₁病毒感染小鼠

在存活实验中，感染IAV的小鼠在第三天出现临床症状，如蜷缩、毛发竖立、嗜睡、毛发皱褶、体重减轻、呼吸窘迫和缺乏食欲。PE组小鼠活动相对较多，但无刺激性或惊厥。在21d观察期间，正常组没有死亡。模型组小鼠从感染后第4天开始死亡（15只小鼠中有1只死亡）。感染IAV后8d致死率为86.6%。PE或奥司他韦治疗的小鼠明显免于死亡（致死率：奥司他韦40%；PE 33.33%）。PE和奥司他韦均能显著提高生存率。同时，与模型组相比，PE和奥司他韦治疗组的寿命显著延长。与模型组相比，PE能显著延长IAV感染小鼠的寿命。模型组小鼠从第3天起体重明显减轻。PE和奥司他韦有效保护感染小鼠免受IAV感染引起的体重减轻（图1）。

伪麻黄碱抑制细胞因子风暴及其炎症基因表达

在流感的早期阶段，细胞因子风暴形成。大量细胞因子的释放是造成细胞和组织[6]损伤的重要因素。在我们的实验中，伪麻黄碱显著降低了细胞因子的释放。肺组织中IFN-γ和TNF-α在第3天显著降低(图2A-B)，血清中IFN-γ和TNF-α在第3天和第5天显著降低(图2C-D)。

流感病毒感染后肺组织的RIG-I和MAVS基因在第3天和第5天高表达，而伪麻黄碱显著抑制RIG-1和MAVS基因的表达(图2E-F)。在另一炎症通路中，伪麻黄碱也表现出对TRL7、MyD88和NF-κB(图2G-I)[7]基因表达的良好抑制作用。

伪麻黄碱能显著抑制IAV的复制

病毒进入上呼吸道后，病毒的几何复制导致上皮细胞损伤成为流感发病的主要机制。在本实验中，伪麻黄碱在第3天和第5天显著抑制AIV病毒的复制（图3）。

伪麻黄碱可明显改善IAV感染后肺病理损伤

iva感染肺炎的特征是肺充血、水肿、气管和支气管内有血性液体、粘膜充血、正常纤毛上皮细胞缺失、粘膜下充血、局灶性出血、水肿和炎性细胞浸润。肺泡腔内有不同数量的中性粒细胞和与纤维蛋白混合的单核细胞。下肺的肺泡常有肺泡内出血和脱细胞的透明膜[8]。在本实验中，各组在不同时间点均未见气管壁异常(未显示)，病变集中于细支气管、肺泡和间质。第1天显示肺小血管炎性细胞浸润。第3天，模型组出现肺泡内出血、透明膜，细支气管壁坏死，大量炎症细胞浸润(淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)。第5天，细支气管壁坏死越来越明显。与模型相比，VR组和VPE组整体病变有明显改善(图4)。

我们之前的研究表明，麻黄及其主要生物碱具有良好的抗炎作用，对D-半乳糖胺/脂多糖诱导的大鼠急性肝衰竭具有高度保护作用，抑制TNF-α等细胞因子[3,9]。

在IVA感染早期，RIG-I(视黄酸诱导基因I)发生构象改变，激活caspase募集域(CARD)间的线粒体抗病毒信号蛋白MAVS，触发IRF-3、IRF-7、NF-κB通路等抗病毒反应，释放丰富的细胞因子[10]。细胞因子风暴是全身炎症反应综合征或多器官衰竭的原因。在本研究中，IFN-γ和TNF-α在IVA感染早期显著升高。RIG-1和MAVS基因也高表达。伪麻黄碱显著抑制IFN-γ、TNF-α、RIG-1和MAVS的表达。在病毒感染炎症反应早期，TRL7和MyD88是细胞因子扩增[7]的重要途径，本研究中伪麻黄碱表现出较好的抑制作用。

IVA的转录和复制是一个发生在细胞核内的复杂过程。核蛋白和基质蛋白M1在复制过程中发挥着重要作用，但目前真正抑制病毒复制的药物较少[11,12]。奥司他韦抑制神经氨酸苷酶，神经氨酸苷酶从新合成的病毒子代中切割末端a-Neu5Ac残基，使其从被感染细胞中洗脱，并寻找新的宿主细胞来感染，阻止IVA传播[13]。在本实验中，伪麻黄碱对IVA RNA的复制有非常显著的抑制作用，这让我们感到惊讶。其抑制机制有待进一步研究。由于伪麻黄碱对细胞因子风暴和病毒复制的抑制作用，肺部IVA感染的病理表现也明显改善，特别是保持了细支气管和肺泡内皮的相对完整。

麻黄是一种人类使用了上千年的药物。从其应用的症状表现来看，本病的表现与流感十分相似。麻黄碱和伪麻黄碱是麻黄的主要生物碱，麻黄碱具有良好的结构，可以产生包括摇头丸、安非他命在内的各种麻醉品，但它们实际上没有成瘾作用。他们是无辜的。麻黄碱虽然具有很强的拟交感神经作用，但在耐受[14]后，伪麻黄碱具有中等的作用，甚至具有一定的降压作用。

由于伪麻黄碱的半衰期短，作用时间短，我们建议临床使用伪麻黄碱缓释剂。即使退烧，也应在24小时内服用三次。在中国，一种称为康泰（GSK产品）的缓释剂含有90毫克盐酸伪麻黄碱和4毫克马来酸氯苯那敏，因此它也用于治疗过敏性皮肤病和普通感冒和流感。

本研究表明，伪麻黄碱对小鼠感染H₁N₁病毒。伪麻黄碱通过抑制相关炎症基因，安抚IFN-γ、TNF-α等细胞因子，抑制IVA的复制，具有良好的抗流感作用。麻黄碱除了作为鼻减充血剂外，还有轻微的肾上腺作用和抑制血管渗出[15]的作用，这可能对流感的早期渗出也有积极的作用。伪麻黄碱是大自然赐予的珍贵礼物，值得进一步研究和探索。伪麻黄碱是一种便宜、容易获得、有效的药物。

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是当前我国严重的传染病。重症患者病死率高，炎症细胞因子风暴是重症和死亡的主要特征[16]。我们认为，伪麻黄碱(包括麻黄和麻黄碱)可能对细胞因子风暴有阻断作用，缓解疾病的发展。

感谢暨南大学田家平医学实验中心提供的实验场所。国家自然科学基金资助项目(No. 81830114, No. 81774164);广东省自然科学基金资助项目(No. 2017A030313737);

1. kmiietowicz Z.世卫组织在审查证据后将奥司他韦降级。BMJ。2017;357: j2841。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28607038
2. 王超，曹波，刘qq，邹志强，梁扎，等。奥司他韦与中药马星石肝银桥散治疗H₁N₁流感：一项随机试验。安实习医生。2011; 155: 217-225. PubMed：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21844547
3. 吴志，孔旭，张涛，叶建军，方振华，等。伪麻黄碱/麻黄碱对脂多糖/d-半乳糖胺诱导的TNF-α介导的急性肝衰竭具有强的抗炎活性。Eur J Pharmacol. 2014;724: 112 - 121。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24365491
4. 伪麻黄碱对缓解普通感冒患儿鼻塞的多中心、随机、安慰剂对照研究美国临床药理学杂志2019;59: 1573 - 1583。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31274197
5. MaratheBM、Mostafa HH、Vogel P、Pascua PNQ、Jones JC等。评估B型流感病毒致病性和奥司他韦治疗的药理学免疫抑制小鼠模型。2017年抗病毒研究；148: 20-31. PubMed：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29100887
6. 李志强，李志强，李志强，等。细胞因子释放综合征的诊断和治疗的现状。血。2014;124: 188 - 195。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24876563
7. 小泰亚罗，沃尔什KB，莱斯S，罗森H，奥尔斯通MB。绘制流感病毒感染期间细胞因子风暴所必需的固有信号级联。2014年美国科学院学报；111: 3799-3804. PubMed：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24572573
8. Richman DD, Whitley RJ, Hayden FG。临床病毒学。第三版，2009年版。
9. 韩颖，朱军，吴志忠。麻黄对d -半乳糖胺和脂多糖所致急性肝衰竭的保护作用。中华干藏兵杂志。2016;24: 127 - 129。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26983481
10. Jacobs JL, Coyne CB。MAVS在线粒体膜上的调控机制。中华医学杂志。2013;425: 5009 - 5019。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24120683
11. 李伟士，许春云，王沛林，黄春云，张晨，等。哺乳动物Ste20样蛋白激酶3核输入和输出信号的鉴定和表征。菲布斯莱特。2004; 572: 0-45. PubMed：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15304321
12. 曹胜，刘旭，于敏，李军，贾旭，等。A型流感病毒的有效复制需要基质蛋白中的核输出信号。J微生物学报。2012;86: 4883 - 4891。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22345442
13. 冯娥，叶东，李军，张东，王军，等。神经氨酸酶抑制剂作为抗流感药物的研究进展。Chem Med Chem. 2012;7: 1527 - 1536。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22807317
14. 李志强，李志强，李志强，等。L(+)伪麻黄碱胶囊在人体内的剂量耐受性和药动学研究。临床药理学杂志，1978;14: 253 - 259。PubMed:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/729619
15. 朗H，亨德森G，弗劳尔R，里特J.朗和戴尔的药理学。爱思唯尔健康科学。2007
16. 特特罗·贾。新冠病毒-19是否接受其他冠状病毒的ADE？微生物感染。2020