集成可能最终代谢产物的gc - ms在识别从植酸酶生产毕赤酵母属Pastoris基于山梨糖醇诱导优化

植酸酶使用的隔离毕赤酵母属Pastoris在甲醇/山梨糖醇co-feeding感应技术调查。细胞外的植酸酶的生物活性优化后共基质诱导4升发酵罐(国家统计局)增加到13250 U /毫升。这导致了509倍增加相比其他类型的植酸酶。这种效果,研究了通过感应与山梨糖醇/甲醇在发酵毕赤酵母属PastorisGS115(狗⁺)在20°C。通过产品的干扰;甲缩醛、乌洛托品和(S) - (+) - 1, 2-propanediol植酸酶的释放毕赤酵母属Pastoris在甲醇诱导下检测并不能仅仅用甲醇诱导压抑。甘油的薄层色谱鉴别分析在甲醇/山梨糖醇诱导和获得的结果相比较小,在植酸酶生产甲醇诱导下孤独。这项工作表明,更高的外源蛋白的表达和美联储分批发酵;表情识别的优势生产植酸酶的一个重要活动。

实际应用

植物衍生产品包括山梨糖醇用作治疗替代药物治疗各种疾病,食品补充剂,可用于许多生产过程。它是细菌的培养基,并帮助区分致病性大肠杆菌O157: H7的其他大多数菌株。细胞生长在甲醇需要高耗氧量。山梨糖醇作为替代廉价co-feeding用于生产蛋白质和是一个non-repressing碳源AOX1启动子的水平没有影响r-protein感应阶段。这份报告描述了植酸酶的隔离毕赤酵母属Pastoris在甲醇/山梨糖醇co-feeding感应技术,山梨糖醇显示承诺co-substrate,它可以增强细胞生长和生产力目标蛋白质。这个co-feeding馈料式感应技术用于重组植酸酶生产在一个小和大规模生产和代谢产物进行了分析。

山梨糖醇异构体的甘露醇可以隔离转换的葡萄糖的羰基羟基通过还原反应。这种变化让后者复合碳水化合物列为多元醇[1]。山梨糖醇作为一种单糖有四个卡路里每克和研究表明,non-metabolite,因为它是新陈代谢比其他糖类更惰性[2,3]。它发现许多应用程序在许多生产过程,作为医药援助,牙膏,糖结晶抑制剂和膳食补充剂[4]。在生物技术,它是有用的作为一种文化媒体区分致病性细菌和允许大肠杆菌O157: H7的其他菌株大肠杆菌[5]。在自然界中,山梨糖醇主要存在于各种植物包括藻类和高等植物。甲醇感应本身是一种高度还原剂释放更大的能量形式热[6],这个过程经历了一个重要的影响在大型甲醇诱导阶段。细胞生长在甲醇,带来了技术挑战因为它需要耗氧量高,和对安全措施的需求由于使用易燃和毒性衬底[7]。最近的研究显示,使用甲醇很便宜和常见的底物时p . pastoris系统介绍了[5、8]。如今,山梨糖醇是一种可用廉价co-feeding生产的蛋白质和non-repressing碳源AOX1启动子的表达水平,因为它不影响r-protein在其感应阶段(1、2、4,11)。许多发酵过程导致蛋白质的生产使用p . pastoris可以执行的最佳感应温度30 0 c,这是一个适合细胞生长的条件。其他的研究表明,山梨糖醇co-feeding技术通过感应阶段关键比甘油和甲醇的混合饲料(7、9、10)。这个过程似乎是有利的,碳水化合物代谢可能扮演一个可行的角色定义源库关系,调节碳分区发展中组织,并最终决定细胞生长[8]。馈料式发酵的过程是为了进行生产高密度培养。自然,在后者的过程,一个增长限制衬底是美联储的反应堆以恒定速率批媒体。这可能是衬底损耗后如甘油。这个过程很简单,非常广泛用于获得高细胞密度栽培(11、12)。的de-repressionAOX1启动子允许细胞准备感应过程(13、14)这个阶段后,甲醇喂养可以诱导执行AOX1启动子。反应器中甲醇浓度的残留是影响甲醇进料数量和控制技术,这是一个特定的增长率文化媒体和蛋白质的表达水平(15、16)。最近,co-feeding甘油和甲醇进行显示缓慢减少甘油喂食,甲醇是增加。甘油和甲醇的混合允许快速感应过程酒精氧化酶和适应的细胞代谢高于甲醇进料过程(17、18)。

甲醇可以作为碳源以及一个重组蛋白表达的诱导物。p . pastoris醉人,相比之下,似乎与代谢物(甲酸、甲醛)的存在高浓度的甲醇,底物亲和力高的酒精氧化酶[19]。因此,在高浓度甲醇阻止生物的发展。

一般来说,常用的甲醇进料技术允许一个常数具体喂养(μ-stat)增长率,常数甲醇浓度喂养,常数DO-based喂养(DO-stat)和temperature-limited馈料式(TLFB) (10、20)。文化对甲醇很便宜,但它增加了流程和成本限制了种植高规模的能力。最有前途的co-substrate山梨糖醇;用于multi-carbon基质混合物代替纯甲醇,因为它可以增强细胞生长和生产力目标蛋白质。本研究关注山梨糖醇/甲醇co-feeding和馈料式感应技术用于重组植酸酶生产在一个小和大规模生产和代谢产物进行了分析。

增长的p . pastorisGS115-pPICZαA-phytase

YPD的准备中含有20 g / l的蛋白胨,10 g / l的酵母提取物,20 g / l的葡萄糖,20 g / l的琼脂和0.1 g / l Zeocin被利用的压力p . pastorisGS115增长转变为重组pPICZαA-phytase面前AOX1启动子和孵化在48小时内30°C。此外,菌落接种到一卷5毫升YPD液体培养基中含有Zeocin(100µg /毫升),并通过摇晃增长在250 rpm 30°C过夜。文化的种子被接种到培养基中含有10 g / l的BMGY酵母提取物,20 g / l的蛋白胨,YNB 13.4 g / l, 4×10⁻⁵g / l的生物素,10 g / l的甘油和0.1米的磷酸钾缓冲溶液pH值6.0。

植酸酶动力学

植酸酶的动力学测定进行了使用各种底物的浓度从0.2到5毫米10毫米的解决Tris-HCl缓冲溶液;与CaCl pH值7.5₂(1毫米)。这一过程伴随着测量酶的活动利用的最佳pH值glycine-HCl 25毫米的解决方案;pH值2.5,0.1毫米醋酸钠溶液pH值(4.0 - -6.5),净化[21]和10毫米Tris-HCl溶液pH值(7.5 - -9.0)。公里的植酸酶值的确定进行了方法后报道(22、23)。另一方面,最优温度测量在不同温度下使用10毫米Tris-HCl缓冲溶液;pH值7.5与肌醇六磷酸酯钠混合和酶反应。酶反应是由添加酶制剂和CaCl₂(1毫米)分钟。公里的决心,,Kcat和Kcat / Vmax执行使用Michaelis-Menten公式和Lineweaver-Burk阴谋。

规模小,细胞密度高发酵

发酵的过程在分批培养,小规模开始转移20毫升pre-inoculum进行无菌的体积是厄伦美厄困惑的玻璃瓶200毫升无菌培养基;500毫升,包含V_R= 100毫升生产介质,在200 rpm和28°C。所需的媒介实验室规模的实验过程包含10 g / l。另一方面,高细胞密度发酵,p . pastoris在批处理模式执行消毒基底盐介质(2.3升)415年国家统计局BioFlo台式SIP发酵罐。BSM的成分中l l:卡索(g / l)₄h·2₂O;0.46 K₂所以₄;9.1,MgSO₄h·7₂O;7.45、KOH;2.06、甘油;40岁的组氨酸;0.4和26.7毫升/ l H₃阿宝₄。的介质的pH值调整(pH = 4.8)与氢氧化铵(25%)和PTM1(6毫升)微量盐/升基盐介质进行无菌(克莱尔,et al . 1991年)。的主要成分PTM1解决方案:6 g / l (CuSO₄奈,0.08 g / l, MnSO 3 g / l₄南无0.2 g / l, 0.02 g / l的H₃CoCl BO3, 0.5 g / l₂ZnCl, 20 g / l₂FeSO 65 g / l₄,5毫升/ l H₂所以₄和0.2 g / l的生物素。各种参数包括搅拌、曝气、温度溶解氧,消泡剂,碳源控制如表1所示。

重复分批培养与外部分离器

美联储重复分批培养的优化生产植酸酶在高细胞密度栽培毕赤酵母属Pastoris进行了使用甲醇/山梨糖醇co-feeding感应技术。馈料式培养时间是通过收获转化为重复馈料式反应器体积的90%,与新鲜BSM介质充电。

生物量和总蛋白分析

细胞生物量的控制是由turbidometric决心或光散射现象的方法。光密度(OD_600海里)是用来表示细胞数量对应的水平散射光的文化肉汤。浊度或光散射测量的波长600 nm使用分光光度计(日立u - 2000)。根据布拉德福德的colormetric Bio-Rad蛋白质测定方法用于确定蛋白质的总量在文化液体。本实验的重点是考马斯亮蓝g - 250的变色染料同时绑定主要基本如精氨酸和胺组的蛋白质。蛋白质的数量以micro-plate的格式,由试验装备和光谱吸收峰在595 nm记录使用ELISA读者(Labsystems Multiskan MS)。

gc - ms分析,提取

分析测量采用气相从美联储反复分批发酵提取分析重组的植酸酶(pPICZαA-phytase)进行高细胞密度栽培毕赤酵母属Pastoris在甲醇在甲醇/山梨糖醇co-feeding感应。后者过程进行了使用来说500珀金埃尔默气相色谱配有Elite-5苯的毛细管柱;5%二甲基聚硅氧烷;95% (30 nm X 0.25毫米X 0.25µmdf ID)和质量检测器turbo-mass黄金在EI模式执行。惰性氦气作为运营商在1毫升/分钟的流量和喷射器操作在290°C。烤箱温度条件设置如下;50°C 8°C /分钟到200°C(5分钟)7°C /分钟到290°C(10分钟)。质谱数据分析(gc - ms)是治疗通过国家标准的数据库和技术(NIST),拥有62000多个模式。未知的质谱分析物与已知样本的光谱(NIST)中存储库和名称、分子量和结构的组件测试材料的确定。

在甘油批处理阶段,文化水平的增长而溶解氧(做)降低,它符合所做的功卡莉,et al . [24]。当大量的甘油在中完全使用做大幅上升。这些结果显示的最后一步开始批处理阶段,和甘油98%馈料式发起的第二步(图1)。连续培养的方法也进行了第一次保持体积取代旧媒体新鲜营养培养基。它的作用集中在维持一个恒定的产品质量以减少副产物的释放中形成甲醇感应孤单。结果表明,植酸酶形成的重复馈料式文化轴承外部分离器在高细胞密度栽培毕赤酵母属Pastoris在甲醇/山梨糖醇co-feeding感应技术增强了活动的49倍相比,甲醇诱导独自在一个反应堆(7公升)(图2),成交的时候维护和发酵过程达到一定阶段后,这不是有效的,90%的媒介被从船,取而代之的是新鲜的营养培养基。在这种情况下没有文化,直到最后阶段批量删除,而体积的减少导致了生产力的增加。一个有效的重复馈料式过程在甲醇/山梨糖醇饲料作为碳源表示OD的显著增加_600海里约5.6倍相比,甲醇诱导。植酸酶形成的优化在甲醇/山梨糖醇co-feeding技术在较低温度提高了活动在高水平[25]。外源植酸酶的表达p . pastoris在低温(2°C)最小化胞外蛋白水解作用,提高了植酸酶生产[26]。不同植酸酶基因序列可用;但问题是要找到一个植酸酶,细胞外高活动和其他参数如温度稳定性、宽pH值最适条件适用于商业用途。如今,methylotrophic酵母p . pastoris被称为一个有效的主机的高水平不等的表达由于其使用甲醇作为能源[27]。

外源蛋白表达的p . pastoris在甲醇的存在是一个极其oxygen-consuming过程和感应在较低温度需要更多的氧气供应。最近,许多研究集中在甲醇的规定使用在基因水平但山梨糖醇在p的影响AOX1诱导策略是很少研究。本研究表明,植酸酶重组有58°C的最佳温度和最佳pH值5.5(数据未显示);在大规模的植酸酶的形成是可能的在高特定和耐热性活动。唯一的区别与其他植酸有两个pH值最优(酸碱2.5和5.5)和最优温度6°C。的评价毕赤酵母属Pastoris重组表达植酸酶和动力学特性。重组的最佳温度和pH值毕赤酵母属Pastoris表达植酸酶是评估在30到70°C的温度范围和pH值范围2 - 9所示。生产植酸酶的最佳温度是58°C时,反应时间是10分钟,和最佳pH值为5.5(图3)。

植酸酶动力学(Kcat /公里),展示了如何有效地一种酶底物转化成产品是4.62 * 107米¹年代¹,即底物从5毫米下降到0.2毫米。在这个过程中,减少50%的时间达到3分钟后不同的反应速率的理论上限——108 - 1010 / M。S [28]。一种酶,接近这个值称为达到超高效率并减少时间经过一段时间的2.5分钟。其他报告显示,一种酶的表达在低温度下应用于促进产量p . pastoris发酵过程,虽然在较高的温度需要很长时间。这份报告的结果表明日益增长的文化首先28°C在甘油批处理阶段(英镑)增加生物质诱导时间之前的水平。较小的培养时间内实现更高的活动与其他的研究。许多报道对植酸酶生产表明,植酸与更广泛的底物通常较低的特定活动。尽管相当大的经济利益,酶形成的低产量和高成本是主要的限制因素的使用植酸酶在动物的饮食。山梨糖醇降低的一个重要思想压力点的积累有毒metabolite-formaldehyde在发酵过程中使用毕赤酵母属Pastoris(狗⁺)通过抑制甲醛异化的途径[29]。期间获得的甘油是唯一的副产品生产植酸酶的形成;通过gc - ms数据如图所示。另一方面,下列化合物如dimethyl-Acetalacetal-of-formaldehyde(甲缩醛)、乌洛托品(乌洛托品)被确认为产品来自甲醛和氨的反应。另一个化合物是目前由(S) - (+) - 1, 2-propanediol甘油的产物,不能压抑的使用甲醇(数据未显示)。后者化合物干扰植酸酶生产毕赤酵母属Pastoris的感应下,甲醇。薄层色谱分析的结果表明,甘油的浓度在甲醇/山梨糖醇诱导技术获得小于甲醇诱导下产生在植酸酶的形成。这表明有太多生产甲醇的甲醛诱导过程。山梨糖醇作为还原剂程度低,non-repressing的碳来源pAOX1和能源供应商减少耗氧率增加热量或甲醇使用这强烈酒精可能是用于生产植酸酶。Co-feeding山梨糖醇的减少氧化过氧物酶体通量,耗氧量和热产生的反应热是高度低于甲醇。这些参数使用重组重要性高细胞密度高的文化p . pastoris菌株的大规模的形成。

在这项研究中,交配因子(因素)prepro-leader一直考虑分泌的植酸酶,修改后的质粒表达植酸酶表达被构造。这个过程是通过把polyhistidine之前停止密码子和原癌基因抗原决定基的标签,这样就不会自然因素从重组植酸酶可以被删除。山梨糖醇酶反应和甘油对重组蛋白生产的影响是非常重要的工具,部分测定代谢可能受益于未来的研究。转植酸酶基因重组的过程存在山梨糖醇/甲醇是有限的知识空白但这个假设的过程可能会讨论SBO(系统生物学本体)省略表达过程;水槽的新陈代谢,知道如何预测将发生在有机反应机理和FBA(通量平衡分析)来预测细胞生长具有不同的碳源。研究扩大我们对山梨醇代谢和生物化学的理解需要被理解,技术集成,建立生化知识转化为计算重建未来的观点。

这项工作是由科技Rwanda-College大学生物技术中心,印度和REB-Rwanda安娜大学。

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