Sequence-independent single-primer-amplification (SISPA)作为筛查技术检测意想不到的RNA在细胞培养病毒侵入特工

sequence-independent single-primer放大(SISPA)使随机扩增核酸,允许不同病毒的检测和基因组测序代理。SISPA方法的这一特性为应用程序的监控提供证据的存在外源RNA病毒在细胞培养。我们评估SISPA方法检测的挑战代表外源RNA病毒在细胞培养的代理。此外,通过优化SISPA方法在我们的实验室中,我们发现假阳性结果在电泳凝胶负控制通道。调查污染的来源,SISPA被克隆到的假阳性结果大肠杆菌细胞、测序和系统分析。这些数据显示,SISPA方法可以作为辅助方法来确认没有意想不到的外源RNA病毒在细胞培养。SISPA污染物序列的系统发育分析表明,造成的假阳性结果商业互补脱氧核糖核酸合成的核酸扩增试剂,可能追溯表达质粒和主机核糖体序列,用于酶的生产。因此,实验室用随机扩增方法必须不断意识到此类污染的潜力,产生假阳性结果和背景噪音在最后总会在读取。

目前很多生活和灭活病毒疫苗在不同的细胞基质是由病毒传播,从主要文化连续细胞系。因此,它增加了外源病毒污染的最终产品的风险。一些最常见的病毒在细胞培养污染包括污染与各种RNA病毒从动物身上提取的原料等各种渠道和实验室人员。这样的污染可以显著的影响诊断和制造实验室[1]。细胞培养的评估,确认没有任何外来的代理是最重要的一个安全测试在生产过程[2]。的常规检测方法检测病毒附着的代理是基于观察细胞病变效应(cpe),红细胞吸附红细胞、细胞或免疫荧光指标。此外,特定的测试如聚合酶链反应(PCR)和抗体检测试验是检测已知病毒侵入代理其他策略。尽管病毒附着剂测试的策略,仍有巨大的挑战从工业的角度来看由于意外noncytopathic病毒污染的生物制品可以代理。因此,有必要对新方法筛查和检测意想不到的病毒侵入代理。随机扩增方法的使用可能会发现意想不到的不定代理之前,我们无法检测。 Sequence-independent, single-primer amplification (SISPA), as a random amplification method, was first developed in 1991 [3]. This method has been used to detect known and/or unknown pathogens in many diagnostic laboratories [4-7]. The random amplification techniques have also been combined with next generation sequencing (NGS) for genome sequencing of viruses, particularly in the case of samples with very small amounts of genomes [8-12].

本研究的目的是筛查检测外源RNA病毒在细胞培养,尤其在样本的情况下,检测结果为阴性预期病毒侵入代理。在这项研究中SISPA方法进行的检测感染性挑战代表外源RNA病毒在细胞培养上清液的代理。此外,通过优化SISPA方法在我们的实验室中,我们发现假阳性结果在电泳凝胶负控制通道。研究污染物的来源,所有试剂,水,一次性用品,工具和重新更换。同时,确认污染源,SISPA被克隆到的假阳性结果大肠杆菌细胞、测序和系统分析。

独立的PCR扩增序列

在这项研究中,执行SISPA方法如前所述[7]。短暂,particle-associated核酸纯化细胞碎片,细菌,和免费的核酸(dna和rna)通过0.2 -µm过滤器过滤(缝匠肌、德国)。同时,核酸酶治疗是通过消化的鸡尾酒DNase(涡轮^TM美国Ambion DNase), Benzonase (Sigma-Aldrich、丹麦),和核糖核酸酶(加拿大生物基本Inc .)。

病毒基因组提取样本,使用FavorPrepTM病毒核酸提取工具包(Favorgen、台湾)。接下来,合成第一链cDNA 20-µL反应混合物,包含12µL病毒核酸,100 pmol底漆K-8N(广汽猫CTA GCG ACC苑可以NNN NNN N), 200 U moloney小鼠白血病病毒(MMuLV) RT (YTA、伊朗)和每个核苷酸的0.5毫米的解决方案。之后,20µL cDNA加热到70°C五分钟,冷却到4°C的20 pmol 1 x的底漆K-8N克莱诺缓冲区。以生产双链dna的固定部分引物K-8N从生成的第一链的互补,5 U的大片段(豆类生物、日本)添加和孵化37°C为60分钟。使用的合成cDNA随后聚合酶链反应(PCR)测定。

进行PCR扩增50-µL混合物,包含10µL第一链cDNA产品,1 x PCR缓冲,0.8µM底漆K(广汽猫CTA GCG ACC苑AC),和2.5 U Taq DNA聚合酶(YTA、伊朗)。最初的变性步骤是在95°C五分钟,其次是5个周期的变性一分钟在95°C,引物退火一分钟在59°C,在72°C,伸长一分钟。33周期也表现如下:95°C 20秒钟,59°C 20秒钟,72°C一分钟+ 2秒每个周期。最后伸长执行步骤7分钟的72°C。

克隆和测序

SISPA方法绑定到pTG19-T所带来的dna质粒(PCR克隆TA工具包、Sinaclon、伊朗)净化后在1%琼脂糖凝胶。的大肠杆菌XL1-blue应变转化为重组质粒,根据制造商的指示。殖民地被蓝白色筛选含重组质粒的筛选。质粒提取使用FavorPrepTM质粒提取迷你包(Favorgen、台湾)。在琼脂糖凝胶质粒的尺寸检查。提取的质粒也会遇到插入,使用与通用M13引物PCR和K底漆。与前后M13引物进行PCR根据制造商的指示(PCR克隆TA工具包、Sinaclon、伊朗)。K的PCR引物是由加1µL 24µL的质粒PCR鸡尾酒由1 X PCR缓冲,每个核苷酸的0.04毫米,2.5 U的Taq DNA聚合酶(YTA、伊朗)和0.8 K的µM引物(如前所述)。循环参数程序作为初始变性在95°C 5分钟紧随其后的是33周期的变性在95°C 1分钟,退火在59°C 1分钟,72°C 1分钟伸长,紧随其后的是最后的72°C伸长了7分钟。PCR扩增子检查在1%琼脂糖凝胶。然后,测序在两个方向进行,使用通用M13正向和反向引物,以确保数据的质量。

检测极限

评估测试的检测极限,提取物稀释系列的腮腺炎病毒(Hoshino应变)使用。的历史发展,星宣流行性腮腺炎病毒减毒疫苗株的前面描述的(13、14)。在目前的研究中,这一毒株是可用的内部。当前的股票在鸡胚胎fibrobalsts传播(cef)和从细胞中提取碎片通过0.2 -µm注射器过滤器(缝匠肌、德国)。悬架包含大约10⁶赛迪50 /毫升的病毒在无菌DEPC-treated连续稀释水。rna提取的样本和rt - pcr扩增了如前所述。染色凝胶后,最后一个可见的DNA提取乐队,克隆和测序如前所述。

污染检测

确认污染源,SISPA也克隆到的假阳性结果大肠杆菌细胞和测序如前所述。

数据分析

序列的同源性与GenBank-deposited序列搜索,使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)。DNAMAN软件包(4.13版)也用于系统发育研究。系统发育树构建的DNA序列,使用neighboring-joining方法。同时,引导测试应用的1000倍。

检测病毒的挑战代表一个不定代理和检测极限

确定此方法检测外源RNA病毒,优化测试方法检测挑战病毒代表一个附着剂使用上层的“(分泌物)(Hoshino腮腺炎病毒株)。腮腺炎病毒是一种包膜单链RNA病毒的消极意义上讲一些小鸡和哺乳动物细胞是宽容的复制。

重要的是,最低病毒拷贝数,能够显示清晰可见的涂片SISPA方法待定。为了实现这个目的,连续稀释10倍的腮腺炎病毒效价是已知的准备。关于结果,最低可检测病毒拷贝数被认为是10²流行性腮腺炎病毒颗粒/ rt - pcr反应(图1)。后来,从每个稀释被克隆到质粒片段产生的。为了筛选插入在质粒的存在,与通用M13引物PCR和K底漆。PCR扩增子检查在琼脂糖凝胶,插入生产两个锋利的乐队被认为包含插入两侧M13和K引物序列(图1 b和c)。此后,几个正被用于克隆测序。测序结果表明,所有序列都在K引物序列两端。腮腺炎病毒的序列从上层清液显示最高水平的同源性(100%),之前的这一毒株基因组测序基因库(加入数字AB470486和MK279727)。这些结果也表明了,虽然102年病毒颗粒能够显示可见涂片在琼脂糖凝胶,105个粒子似乎导致足够的特定病毒PCR产物。换句话说,在样本中含有病毒拷贝数低于10⁵粒子,大多数克隆含有非特异性序列。因此,结果表明,SISPA方法是高效作为样本的方法检测外源制剂与大于10⁵每个反应病毒颗粒。这些条件似乎适合筛选外源病毒药物在细胞培养,因为大多数样本含有更多的病毒拷贝数由于浓缩可检测子代病毒人群的传播在允许细胞基质。

污染物序列

假阳性结果(明确涂片在尺寸范围50 - 800 bp的一些著名乐队)后得到SISPA方法的应用。这是怀疑扩增试剂污染的来源。这可能与微量的核酸的存在(例如,表达向量和原核表达的宿主的化合物),通常用于商业生产的酶。通过这样的假设,SISPA被克隆到的假阳性结果大肠杆菌细胞,测序链,和系统分析。

几个克隆,测序,显示下面的同源性。所有序列都在K引物序列两端。一些克隆了小鼠白血病病毒序列。标准的核苷酸分析显示,爆炸序列的同源性最高水平(100%)和几个M-MuLV波尔基因序列(图2)。其他扩增子的测序显示高同源性与BL21 (100%)大肠杆菌23 s rrna。高与其他菌株的序列同源性被发现大肠杆菌核糖体rna(图2 b, C)。M-MuLV波尔基因的检测大肠杆菌假阳性结果中核糖体rna序列扩增子显示剩余核酸序列在商业互补脱氧核糖核酸合成试剂引起的假阳性结果。唯一现实的解释这些观察cDNA占合成试剂含有微量的核酸。小鼠白血病病毒的存在(MLV)序列在其他商业实验室试剂之前报道使用rt - pcr分析,全称异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒与特定的引物(XMRV)和MLV [15 - 17]。先前的研究也报道污染其他商业试剂不同的细菌基因组和其他dna (18 - 24)。目前的研究表明,微量的核酸在商业实验室试剂,用于随机扩增方法,可能有问题,产生假阳性结果和背景噪音在最后总会在读取。

总之,SISPA方法应该是特别有用的筛查意想不到的外源RNA病毒的细胞培养,检测结果为阴性预期病毒侵入代理。现在发现还没有证实试验表明,商业互补脱氧核糖核酸合成装备不应该用于随机扩增方法,比如SISPA。此外,结果强调了需要控制不同的步骤随机扩增的方法来验证他们的使用可用于诊断和门店。同时,应该小心的污染其他SISPA评议。

作者感谢人类病毒疫苗部门人员Razi疫苗和血清研究所的技术援助。

1. Petriccani J,床单R,格里菲斯E, Knezevic即外源病毒疫苗代理:教训4案例研究。生物制剂。2014;42:223 - 236。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25135887/
2. 克利夫兰MH, Anekella B,布鲁尔M,下巴PJ,沙发H, et al . 2019 NIST-FDA车间的报告标准,下一代测序检测病毒附着剂在生物制剂和生物制造。生物制剂。2019;64:76 - 82. - pubmed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32094072/
3. 雷耶斯GR JP。Sequence-independent single-primer放大(SISPA)复杂的DNA数量。分子和细胞探针。1991;5:473 - 481。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1664049/
4. 他安布罗斯,Clewley JP。病毒的发现,序列的独立的基因组扩增。牧师地中海微生物学报。2006;16:365 - 383。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16929467/
5. Kellam p .本科福德刚N,更多宏基因组和分子识别的新型病毒。Veterin j . 2011;190:191 - 198。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21111643/
6. Djikeng,哈尔平R, Kuzmickas R, Depasse J, Feldblyum Sengamalay N, et al。随机启动病毒基因组测序的方法。BMC基因组学。2008;9:1 - 9。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18179705/
7. 维多利亚詹,Kapoor Dupuis K, Schurr DP, Delwart EL。快速识别已知的和新的RNA病毒从动物组织。PLoS病原体。2008;4:e1000163。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18818738/
9. 阿方索CL。禽流感病毒基因组的测序后随机扩增。生物学技术。2007;43:188 - 192。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17824386/
10. 公里,Bishop-Lilly KA, Turell MJ,维尔纳巴塔,诺兰NM, et al .虫媒病毒病媒昆虫的检测快速、高通量焦磷酸测序。《公共科学图书馆·被忽视的热带疾病。2010;4:e878。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21085471/
11. Blomstrom基地,扩大F,锤,Belak年代,Berg m .检测脑组织的小说astrovirus貂遭受震动貂综合症病毒宏基因组的使用。中国Microbiol。2010;48:4392 - 4396。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20926705/
12. Marcacci M, Deluca E,扎克,Ditommaso M, Mangone我,et al。猫麻疹病毒的基因组特征来自意大利。J Virologi冰毒。2016;234年,160 - 163。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27155238/
13. 维多利亚詹,卡普尔,李L, Blinkova O, Slikas B, et al。宏基因组分析病毒的粪便样本儿童急性弛缓性麻痹。J微生物学报。2009;83:4642 - 4651。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19211756/
14. 佐佐木K, Higashihara M,井上K, Igarashi Y,牧野美国研究流行性腮腺炎病毒减毒活疫苗疫苗的发展。即衰减的Hoshino株腮腺炎病毒“荒原”。北里拱费用医学。1976;49:43-52。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/828947/
15. 牧野年代,Yammane Y,佐佐木K, T长岛,Higashihara m .研究流行性腮腺炎病毒减毒活疫苗疫苗的发展。二世。开发和评估现场Hoshino流行性腮腺炎疫苗。北里拱经验医学。1976;49:53 - 62。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1025341/
16. Carrigan诺克斯K, D,西蒙斯G, Teque F,周Y, et al。没有证据表明murine-like gammaretroviruses CFS患者之前确认为XMRV-infected。科学。2011;333升94 - 97。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21628393/
17. 佐藤E, Furuta RA, Miyazawa t .内源性小鼠白血病病毒基因组污染物在一个商业rt - pcr工具包是XMRV放大使用标准的引物。Retrovirology。2010;7:110。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21171978/
18. 贾郑H, H, Shankar Heneine W,瑞士人WM。检测小鼠白血病病毒DNA或鼠标在商业rt - pcr试剂和人类的DNA。《公共科学图书馆•综合》。2011;6:e29050。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22205995/
19. Champlot年代,Berthelot C, Pruvost M,贝内特EA,田庄T,等。一种有效的多策略的DNA去污过程为高度敏感PCR应用PCR试剂。PloS one。2010;5:e13042。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20927390/
20. 埃文斯通用电气,默多克博士,安德森TP,波特HC,乔治点,等。污染与军团菌DNA试剂盒提取的DNA试剂盒。中国Microbiol。2003;41岁,3452 - 3453。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12843121/
21. Koncan R,瓦尔韦德·莫洛西尼MI, Garcia-Castillo M,广州R, et al。从错误中学习:污染的Taqβ-lactamase序列包含TEM导致错误出现肺炎链球菌。J Antimicrob Chemother。2007;60:702 - 703。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17597059/
22. Muhl H, Kochem AJ, Disque C, Sakka SG。活动和商业聚合酶链反应试剂的DNA污染普遍16 s rDNA实时聚合酶链反应检测细菌病原体的血液。成岩作用Microbiol感染说。2010;66:41-49。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18722072/
23. Newsome T,李BJ,邹N, Lo SC。细菌的存在商业Taq phage-like DNA序列DNA聚合酶试剂。中国Microbiol。2004;42:2264 - 2267。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15131208/
24. Thoendei M, Jeraldo P, Greenwood-Quaintance KE,姚明J, Chia N, et al。污染的影响在全基因组扩增的DNA试剂盒用于宏基因组的测序感染诊断。中国Microbiol。2017;55岁:1789 - 1801。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28356418/
25. 沃利N,施耐德,Thannesberger J, Kastner M, Bakonyi因T, et al .质粒DNA分子试剂的污染物。2019年Sci众议员:9:1 - 11。PubMed:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30733546/