粪便贮存条件诱发变异的微生物组成和微分宏基因组分析的解释

宏基因组的进步促进人口研究微生物组成和主机之间的关联特性,但在这些人口分析策略来减少偏见是必要的。然而,储存条件的影响,包括冻结和保存缓冲区,在粪便样本的微生物种群尚未充分研究。在这项研究中,我们调查了宏基因组差异粪便样本存储在不同的条件。我们收集了46名肺癌患者的粪便样本。DNA的质量和微生物组成在不同存储方法比较在16 s rRNA测序和岗位分析。DNA的质量和测序结果两个存储条件(冻结和保存在缓冲区)没有显著差异,而微生物信息被冷冻保存在缓冲区比。在宏基因组分析,我们观察到微生物组成的距离很小在同一个存储条件。分类注释表明许多微生物之间的许多不同冷冻和buffer-preserved粪便。特别是,厚壁菌门和拟杆菌门的丰度的变化取决于存储条件。属于这些类群的微生物不同,导致偏见在人口宏基因组分析。 We suggest that a unified storage Methods is requisite for accurate population metagenomic studies.

肠道微生物与人类健康协会逐渐变得清晰起来。有令人信服的证据对肠道微生物的影响在不同的生物过程,包括代谢,脑功能、消化、营养储存,和免疫[1]。分析微生物有效运转和准确性,下一代测序宏基因组分析工具已经开发[2]。人口宏基因组研究是重要的验证和减少选择偏倚。许多人口宏基因组研究揭示微生物组成和主机之间的关联属性的药物、位置、代谢功能,和疾病[3 - 5]。然而,意想不到的偏见可以发生在ununified工具、实验用品,使用和储存条件。

粪便存储是可靠和准确的宏基因组分析的一个重要步骤,因为微生物及其DNA / RNA是敏感的外部环境,包括氧气和温度(6 - 10)。测序的16 s rRNA地区是一种常见的方法为研究肠道微生物组成映射到参考序列(3,11)。不稳定的储存粪便样本能破坏微生物信息(DNA和RNA)和诱导错误在序列数据和宏基因组分析[12]。来阻止这些改变并确保宏基因组分析的准确性,粪便应完好无损(13、14)。存储在-80°C或液态氮是一种常见的方法来防止退化和微生物组成的变化(15、16)。粪便样本往往从许多网站,和研究人员可能在极低的温度下存储问题。各种工具,如DNA / RNA盾牌,开发维护粪便的原始条件(15、17、18)。然而,不同的粪便储存条件的影响在同一微生物种群尚不清楚。

在这项研究中,我们研究了不同的宏基因组结果粪便从相同的人口获得存储在不同条件下。我们比较粪便样本存储在-20°C -80°C和那些存储在保存缓冲区(DNA / RNA盾)在4°C。我们分析中提取DNA的质量,测序结果,多样性,和分类分布来确定粪便储存条件的影响。我们发现不同的存储方法导致了不同的微生物组成,尽管人口获得相同的粪便。因此,我们建议,研究人员使用一个单一的存储方法和准确的宏基因组分析的结果一致。

粪便样本收集、储存条件和DNA提取

新鲜粪便收集来自46个肺癌患者。22立即粪便样本存储在-20°C和运输在-80°C到冰箱使用。24粪便样本立即保护存储在缓冲区(美国Zymo欧文CA)在4°C 1年之前使用。DNA提取进行了使用500毫克的粪便样本使用FastDNA®旋转工具土壤(MP生物医学,梭伦、钙、美国)& PowerFecal DNA隔离设备(莫生物、希尔登,德国)根据制造商的建议。DNA纯度和数量估计使用NanoDrop分光光度计(美国马热科学、沃尔瑟姆)。

宏基因组16 s rRNA测序数据分析

分析了原始序列读取使用的质量FastQC [19]。Illumina公司适配器paired-end读取序列被使用cutadapt version 2.2 [20]。然后,修剪序列加工使用QIIME2 version 2019.4 [21]。短暂,读取被分配到每个样本根据惟一索引;对读取从原始DNA片段在QIIME2合并使用导入工具。从fastq文件,删除嵌合体DADA2的共识方法实现是使用。α多样性评估使用q2-diversity插件QIIME2稀疏。使用非参数统计分析α多样性指数进行测试。分类注释是由映射训练参考集与引物(向前,5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′;相反,5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)提取V3-V4地区使用绿色煤电版本13 _8 [21]。 Linear discriminant effect size analysis (LEfSe) [22] was performed to identify differential features at the species level between groups base on linear discriminant analysis (LDA) scores. Statistical plots and calculations were generated using R and R studio [23] with the ggplot2 package [24].

演示粪便储存条件和人口结构之间的关系从宏基因组分析,推断出46收集粪便样本人口从一个肺癌患者(表S1)。22粪便样本存储在-20°C以上的12个月,然后运送到-80°C(冷冻粪便)。其他24粪便样本存储在保存缓冲区(buffer-preserved粪便)。这些46粪便样本细胞溶解进行DNA提取和测序分析(图1)。在这里,我们分析了冷冻粪便长时间在-20°C和buffer-preserved粪便主要。

质量比较冷冻和buffer-preserved粪便样本在DNA水平

我们比较储存粪便样本中提取DNA的数量来确定不同的贮藏条件的影响。buffer-preserved粪便的DNA的浓度明显高于从冰冻的粪便(p< 0.005,图2)。我们也确认没有偏见引起的杂质影响浓度的测量(图2 b)。尽管不同浓度的提取DNA, V3-V4地区成功放大聚合酶链反应(PCR)。为了防止从测序过程偏差,我们获得的序列读取计算和验证,没有冻结和buffer-preserved粪便样本之间的数量差异(图2)。我们削减了适配器,加入了读取和排除嵌合体,quality-reads低。配对阅读数高buffer-preserved比冷冻粪便排泄物,表明微生物DNA完整时存储在保存缓冲区(p< 0.05,图2 d)。

基于微生物的微生物多样性组成粪便储存在不同条件下的距离

调查是否微生物状态取决于储存条件不同,我们比较微生物多样性在冷冻和buffer-preserved粪便。我们评估α多样性和观察到个体变异大于冷冻和buffer-preserved粪便之间变化。特别是,buffer-preserved粪便的物种数量显著高于在冰冻的粪便,但其他α多样性指数并没有表现出显著差异(图3 a - c)。然而,β多样性显示分散个人依赖于存储方法(图3 D,p= 0.001)。我们发现系统的距离(距离序列)加权微生物丰度也将个人分成两组(图3 d)。在这里,我们发现冷冻粪便与壁厚菌门主要协调,拟杆菌门协调buffer-preserved粪便。这些微生物特性变化可能还受到时间的影响在-20°C转移在-80°C(图3 d)。这些结果表明,不同储存条件下诱导变异的微生物组成的人口。

宏基因组分析的粪便在不同储存条件下的微生物组成

接下来,我们进行分类注释的微生物检测冷冻和buffer-preserved粪便样本之间的差异。我们发现6门,20属,15种不同储存条件之间的显著(表S2)。前6个类群数量计算每一层的总结(图4)。在门级,厚壁菌门在冷冻粪便和拟杆菌门更丰富更丰富buffer-preserved粪便(图4 a、B图S1)。有趣的是,大量的拟杆菌门很低在冰冻的粪便,而厚壁菌门是丰富buffer-preserved粪便。因此,大多数属(图4 c, D)和物种(图4 e, F)包含在这些类群之间显著不同冷冻和buffer-preserved粪便(图4)。大多数物种丰度的结果都符合相应的门和属。这些结果表明,不同的粪便储存方法诱导粪便的微生物组成的变化。

在这项研究中,我们收集了捐赠者与肺癌的粪便样本调查的影响不同储存条件的人口宏基因组分析的结果。在这里,我们使用了一个肺癌的队列,因为它是容易获得美国和肺癌并不认为是与戏剧的微生物变化与结肠癌,尽管最近的研究强调了与癌症微生物协会(25 - 28)。此外,健康人类军团的先前的研究表明,每个人都有一个独特的肠道微生物组签名,因此微生物的健康人口显示相对广泛的细菌多样性[29-32]。粪便储存冷冻保存在-80°C和缓冲区。我们发现不同的粪便储存诱导成分差异引起的肠道微生物群落和摘要变异。特别是,我们的丰度差异的主要类群,厚壁菌门和拟杆菌门人口分割为两个微生物群落的主要因素。大多数属物种丰度的差异属于厚壁菌门和拟杆菌门,但其他类群丰富冷冻和buffer-preserved粪便之间也有所不同。总体而言,我们的研究结果表明,可靠和准确的人口宏基因组分析没有偏见需要使用一个单一的存储方法和高度控制条件。

不同DNA提取试剂盒、测序平台和分析工具可能导致进一步的偏见和差异宏基因组分析的结果。因此,一个一致的实验方法是至关重要的(2、7、8,17)。例如,我们使用Illumina公司测序16 s rRNA地区MiSeq平台针对V3-V4地区和映射序列读取到绿色煤电数据库(3、33、34)。我们获得的序列读取每个样本没有读计数差异两个存储条件。加入顺序读取和过滤低质量的读取,通过QIIME2 DADA2被使用,这是一个快速和准确的宏基因组分析工具(21岁,35岁,36)。我们观察到paired-end读取的数量差异,表明不同的储存条件可以产生不同的微生物信息。

香农指数通常用来评估α多样性、丰度和均匀度[37]。在这项研究中,我们发现,均匀度在冰冻的粪便往往高于buffer-preserved粪便。我们推测,这种差异减少了香农指数差距,尽管巨大的差异对物种。相反的结果是通过Menke et al .,他透露,冷冻粪便的α多样性高于buffer-preserved粪便在羊[38]。这种差异可能是由于不同的特点人类和羊微生物群组成[39、40]。个人捐助者之间的α多样性的变化往往是观察,可以解释为饮食,生活方式,和遗传因素[41-43]。这些特征取代α多样性的个体变异。比较微生物多样性之间的人群,我们绘制个人基于加权UniFrac距离。尽管捐助者广泛的α多样性值,β多样性表明,微生物距离取决于存储方法。这一结果表明,存储方法可能影响粪便的微生物组成。

在目前的研究中,我们发现不同分类单元来确定特定的微生物之间的冷冻粪便和buffer-preserved粪便。与先前的研究一致(44岁,45岁),我们观察到,厚壁菌门更丰富冻结比buffer-preserved粪便排泄物,而拟杆菌是buffer-preserved粪便更丰富。重要的是,拟杆菌的数量很低在冰冻的粪便,即使拟杆菌门已知人类居住在胃肠道(45、46)。这可以解释为不同类型的细胞壁厚壁菌门和拟杆菌门之间。Faecalibacterium buffer-preserved粪便的更丰富的比冷冻样品的4倍。Faecalibacterium的增加也观察到在其他研究中使用替代缓冲区[6]。随着壁厚菌门的增加,下游属物种也增加了冰冻的粪便。Lentisphaerae和Fusobacteria通常在粪便中发现在低丰度[47、48],但相对丰度是零在buffer-preserved粪便冷冻粪便和较低。这些差异在某些微生物类群可能会导致偏见和不平衡的宏基因组分析。

这项研究有一些局限性。首先,比较相同的粪便样品使用不同的存储方法评估intra-sample变化没有执行。然而,我们收集的粪便从捐赠者在同一类型(肺癌患者),提供均质化和足够取代个体内部比较。第二,只有一种类型的保存缓冲区用于比较分析。比较在不同保存缓冲区应该是进一步研究的重点。事实上,许多研究已经比较各种缓冲区[49]6日,15日,18日,但结果的再现性。最后,还需要进一步的研究来证明inter-individual变异对粪便储存条件,使用从其他人群收集粪便样本建立我们的研究结果的普遍性。

伦理批准和同意参与

所有样品都获得知情同意后参加三星医疗中心的书面形式。本研究通过三星医疗中心机构伦理委员会与美国卫生部和机构审查委员会(IRB)符合赫尔辛基宣言(2008-06-033)。

同意出版

所有样本获得知情同意在三星医疗中心出版。

资料汇总

的16 s rRNA欧洲核苷酸测序数据归档库,(加入#:ERP116098)。生成的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

作者的贡献

G。K 16 s rRNA序列,分析数据和写的手稿。C。P写的手稿。K.H.K 16 s rRNA序列分析。年代。K手稿编辑和数据。Y。Y编辑了手稿。 S.E.L edited figures. Y.K edited. manuscript. K.W.Y and H.P designed and supervised all experiments and analysis. All authors have read and approved the manuscript.

我们要感谢Drs。Se-Hoon李收集和允许我们使用来自病人的粪便和他的支持。

Athours笔记

内的所有支持数据和协议提供了文章或通过辅助数据文件。†这些作者的贡献同样这项工作。

资金

这项研究得到了国家研究基金会的生物医学技术发展项目(NRF)是由科技部和ICT (NRF - 2017 m3a9f3046536)和要点研究所(GRI)格兰特于2018年由要点,2019年和2020年。

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