影响ICSI精子DNA碎片的结果:一个前瞻性研究

目的和目标:的主要目的是测量精子DNA损伤和研究精子DNA损伤的大小。次要目标是研究精子DNA碎片的影响5天囊胚的扩张(评分1 - 5)。

结果:有一个增加精子DNA碎片随着年龄的增加。增加精子DNA碎片也与异常运动和形态精液样本。然而,没有减少扩张或等级的胚泡。

结论:精子DNA碎片测试是一个有用的调查原因不明的不孕。然而,精子DNA碎片没有显著与第五天胚胎年级ICSI周期。

博士论文工作生殖医学奖学金的学生:Ramya哈瑞

精液分析,传统上作为每2010年包括精子体积、液化时间、精液酸碱度、精子浓度、精子形态,精液果糖,精液精子能动性和活性氧化物种(ROS)。世卫组织1999年指南还分析了精子凝集试验和白细胞浓度。这些实验室测试了人类精子的形态和功能,但是这种分析可能没有揭示缺陷精子DNA [1 - 3]。有趣的是,只有15%的不育男性精液分析正常按指南[4]。精子DNA损伤是否不利影响生殖的结果在自然和人工辅助受孕是一个有争议的问题。一些研究已经表明,不成熟的核蛋白质和精子DNA单引号和双链断裂会导致移植失败,降低临床怀孕率和早期流产[4]。最近,许多技术旨在改善传统ICSI精子选择了增加受精率,提高成功受精后胚胎质量,优化怀孕率。DNA损伤可能发生在单引号或双链断裂的形式,和两种类型可以通过不同的方法进行分析和量化。这些精子染色质扩散试验(SCDT),精子染色质结构分析(SCSA),原位转移介导dUTP尼克结束标记测定(TUNEL)和单细胞凝胶电泳试验(彗星)(5、6)。Spermatogonia主要发育成精子,然后到二级精子,它摆脱了细胞质形成精子。 DNA in spermatogonia is mainly histone bound and protamination of DNA takes place in testicular seminiferous tubules. During the process of sperm DNA maturation histones are replaced by protamine that are half the size of histones. In the mature spermatozoon nucleoprotein, 85% of mature sperm DNA is bound to protamine I and II and 15% of sperm DNA is bound to histones [7,8]. If histones are bound to > 15% of DNA it is termed as immature nucleoprotein and it has been postulated by a few studies as the most likely etiology of sperm DNA defects. The other etiological factors are varicocele, increased testicular temperature, stress, aging, increased BMI (Body Mass Index), smoking, and infrequent ejaculation [9,10]. Other factors are environmental pollution, male genital tract infections, toxins, radiation exposure, diabetes, testicular cancers and abuse of recreational drugs and caffeine. The biological mechanisms involved are defective protamination, increased apoptosis and oxidative stress. Defective protamination happens in the testes. Oxidative stress mostly happens as a result of sperm motility and metabolism while transit through the epididymis [11,12]. Apoptotic stress can happen either in testes or in the epididymis. Presence of leukocytes and immature sperm also add to the oxidative stress. Oxidative stress is sometimes also due to low antioxidants in the seminal plasma[13,14].

精子的氧化物种需要适量的精子获能的精子,顶体反应,然而大量超激活和卵母细胞融合可能产生精子DNA损伤。精子DNA碎片测试可能表示在工作原因不明的不孕,反复植入失败,复发性流产,年龄> 40岁,精索静脉曲张和代谢逮捕在压实阶段的胚胎。在人类胚胎基因组后卵母细胞依赖,直到第三天胚胎基因被激活。胚胎基因的激活是一个复杂的过程。胚胎基因组激活的失败会导致代谢块胚胎在3天。因此,本研究的主要目标是识别精子DNA碎片测试临界正常值夫妻的角色与其他传统的精子分析和关联参数。次要目标是与胚胎trophoectoderm关联精子DNA碎片,内细胞团的特点。

这是在美国进行的一项前瞻性研究Saveetha医学院妇产科和弧不孕不育医院。研究计划批准,所有收集的数据由机构伦理委员会审查批准和审查委员会。通知书面同意在当地语言来自所有参与者的夫妇。这项研究的目的是探讨影响ICSI精子DNA碎片。六十夫妇(原发性或继发性不孕症)从一年被列入研究。

男性伴侣的精子浓度至少1 x106 /毫升的精液被包括在内。夫妇与已知妇科病理(例如,已知的子宫内膜异位,子宫肌瘤,和以往任何操作妇科器官)被排除在外。新鲜胚胎移植周期和捐献卵子接受者也被排除在研究。

通知书面同意来自男性伴侣参加不孕症诊所为精子DNA碎片测试SCD(精子染色质扩散)方法。精液样本收集的自慰性禁欲2 - 5天后。精液被允许进行液化。DNA碎片研究了SCD方法(光环视图中,DNA碎片工具包)。在测试之前,精子浓度稀释到5 - 10百万每毫升(稀释,Vitromed V-sperm包含消息灵通的洗,公路信托基金和HSF)。如果精子浓度低于500万/毫升精液样本离心机和颗粒被用于染色质分散测试。

精子染色质扩散试验协议有5个步骤

步骤1:试剂准备:在第一步中所有试剂都带到室温准备工作解决方案集中原液染色的。染色工作的解决方案是添加染色原液与磷酸缓冲盐和蒸馏水(比)。

步骤2:样品制备:琼脂糖凝胶融化在90度5分钟在水里洗澡。琼脂糖凝胶现在放置在37度水浴和允许平衡。精液样本添加到融合琼脂。立即精液琼脂糖混合物用移液器吸取了诽谤了幻灯片和盖玻片放置。现在的幻灯片放在4度5分钟与精子细胞产生微凝胶嵌入。

步骤3:变性和溶菌作用:在这一步中盖玻片是轻轻地取出精子与酸变性琼脂糖涂片覆盖解决方案7分钟。后的精子琼脂糖涂片与溶解缓冲区覆盖了25分钟。现在的幻灯片是与充裕的蒸馏水清洗5分钟。

第四步:固定和染色:现在涂片脱水逐渐连续添加70%酒精,其次是90%的酒精和100%的酒精紧随其后2分钟,然后风干。修复后染色之前准备工作的解决方案覆盖5 - 10分钟染色涂片。强染色优先实现简单的可视化的外围分散DNA环晕。

第五步:观察和解释:幻灯片是x亮视场照明观察40岁以下。至少有200精子数和得分模式建立了费尔南德斯,et al .精子DNA碎片(DFI %)计算分散的精子DNA /总精子数。表1给出的解释晕大小和精子DNA碎片。精液样本由ICSI的密度梯度方法。磁辅助细胞排序是DNA碎片超过30%时完成的。传统ICSI是和胚胎培养,直到第五天使用Vitrolife一步媒体。

年龄、运动和形态,精子DNA碎片和天5-embryo级(等级1 - 5基于囊胚的扩张,内细胞团和trophoectoderm形态)被记录。

统计分析

数据分析和图形记录。描述性和推论统计分析数据。比较年龄、精子数、精子活力和精子形态进行了使用卡尔·皮尔逊相关系数(r)是用于衡量两个变量的线性相关。相关系数,1 < = r < = 1, 1代表强烈正相关,1代表强烈负相关,0表示没有相关性。散点图绘制使用笛卡尔坐标显示两个变量的值。卡方检验与橡胶树的校正用于分析分类变量。统计分析使用统计软件完成了MEDCALC(比利时)。

参与者的平均年龄是35.83 + 4.81。发现随着年龄增加精子数量不影响虽然运动和形态受到影响。随着年龄的增加有增加精子DNA碎片。观察一个无意义的正相关DNA分裂和精子的运动性之间。一个无足轻重的负相关也观察到分裂和形态学之间的关系。表2总结了人口统计变量和精液参数之间的相关性。精子DNA碎片还显示不影响胚泡扩张(表3)。增加精子DNA碎片超过30%也不是与trophoectoderm或内细胞团等级(表4、5)。

精子DNA包含过渡核蛋白质(tnp)和鱼精蛋白螺旋管而不是在体细胞组织蛋白,卵母细胞[15 - 17]。图1阐述了组蛋白的精子染色质DNA排列和替换与鱼精蛋白核蛋白质成熟。最常见的缺陷是单链和双链DNA断裂。其他缺陷修改基本删除和基地。除了可以有国米和intrastrand交叉链接(图2)。

protamination过程有几个优点(a) DNA冷凝的结果在一个较轻的原子核容易提升精子进入女性生殖道(b)增强DNA稳定自由基生成的精浆由于精子能动性和新陈代谢(c)体细胞表观遗传基因的精子核使自由重组配子配合后的卵母细胞(d)检查精子形成点(protamination可以作为检查缺陷点出现凋亡通路)(e)激活卵母细胞受精后(18、19)。胚胎分级系统(园丁和Schoolcraft)图3中阐述了得了。

protamination的过程有时可能与DNA受损有关。DNA碎片在人类精子细胞凋亡的一个特点,和可能是由于酶异常活动和等离子体膜蛋白介导的Fas。先前的研究表明,细胞凋亡增加不育男性的精液。细胞凋亡也增加了样品不正常精子形态[10]。符合其他的研究,这项研究也表明,随着年龄增加,增加精子DNA碎片。图4显示了精子染色后光环测试。

卵母细胞有修复机制在精子DNA修复裂缝的最近的研究证明虹鳟鱼卵母细胞和胚胎(21、22)。我们的研究还发现,与精子DNA碎片> 30%没有影响胚泡在人类胚胎的扩张。内细胞团和trophoectoderm年级也与精子DNA碎片(> 30%)。

精子选择方法的使用,例如密度梯度离心法和游过,促进精子与最大TEL-DNA(端粒DNA)重复选择,有利于提高胚胎质量。此外,新的精子选择方法如磁辅助细胞排序中使用高DFI样本也可以改善ICSI的各种研究结果正如(第23 - 25)。

最常见的缺陷是单链和双链DNA断裂。其他缺陷修改基本删除和基地。除了可以有国米和intrastrand交叉连接。

单链断裂和基本成熟精子中dna修复的卵母细胞的帮助下误码率(基本切除修复)路线之前的融合染色单体(26、27)。双链断裂可以修复的受精卵NHEJ(非同源末端连接)和人力资源(同源重组)途径[28]。在受精卵的阶段,非同源末端连接机制可以帮助修复双链断裂。然而,同源重组有助于第一阶段的胚胎阶段的细胞复制(29、30)。

一些研究强调了角色抗氧化治疗和精索静脉曲张修补,防止精子DNA碎片。禁欲时间短、适当的精子处理实验室可能防止精子DNA碎片。德莎icsi也可能有助于防止精子DNA碎片在运输途中由于氧化应激在附睾和输精管。

精子DNA缺陷可以有几个病因和机制。精子DNA碎片分析补充完成常规精液分析。精子DNA的缺陷类型,网站和严重程度以及卵母细胞修复能力确定生殖的结果。在未来的研究中,各种精子选择标准需要比较。精子DNA缺陷的卵母细胞修复机制也需要确认。

精子DNA碎片测试是一个有用的调查原因不明的不孕。与父亲年龄的DNA碎片增加。精子数;运动和形态与精子DNA分裂指数无显著关系。此外,精子DNA碎片与第五天胚胎没有重大协会年级ICSI周期。未来与大样本的前瞻性研究尺寸需要确认这些初步研究结果。

作者感谢群弧机构和Saveetha医疗和技术科学研究所提供的基础设施和支持的行为研究。

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